FTY720對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用

張杰 董曉巧 俞文華 杜權(quán) 王昊 楊定博 沈永鋒 江力 朱強(qiáng) 車志豪

免疫反應(yīng)是造成蛛網(wǎng)膜下腔出血性腦損傷的重要原因之一[1-2]。FTY720是一種來源于冬蟲夏草且具有雙向調(diào)節(jié)作用的新型免疫抑制劑，在體內(nèi)抑制免疫反應(yīng)發(fā)生的同時(shí)不破壞機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答及免疫記憶能力，不良反應(yīng)小，生物利用度高[3]。FTY720可用于器官移植、自體免疫疾病、腫瘤、炎癥等疾病的治療；目前，在腎移植排斥反應(yīng)中的應(yīng)用進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，在多發(fā)性硬化癥中的應(yīng)用進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)[4-7]。本研究采用FTY720腹腔注射治療大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血，觀察其對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用，從而揭示其腦保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康Wistar大鼠（雄性，清潔級(jí),南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供）；FTY720（批號(hào)：SML0700，規(guī)格：25mg，美國(guó)Sigma公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號(hào)：23229，美國(guó)Thermo Scientific公司）；原位末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（批號(hào)：MK1024，中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司）；Caspase-3和Caspase-9底物（批號(hào)：T9281、T9275，美國(guó) Livemore公司）；轉(zhuǎn)印槽（型號(hào)：Trans-Blot，美國(guó) Bio-Rad公司）；電泳儀（型號(hào)：EPS-200，上海天能科技有限公司）；小型垂直電泳槽（型號(hào)：164-8001，美國(guó) Bio-Rad公司）；脫色搖床（型號(hào)：TY-80B，常州澳華儀器有限公司）；生物倒置顯微鏡（型號(hào)：IX-71，中國(guó)奧林巴斯有限公司）；低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：BECKMAN，北京普瑞麥迪實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；熒光分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-1202，日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將48只大鼠隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組，每組12只。4組大鼠均予50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉，采用枕大池二次注血法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型，假手術(shù)組大鼠兩次注入等量0.9%氯化鈉注射液。治療組大鼠模型形成前0.5h按1mg/kg腹腔注射FTY720，另外3組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液1ml。24h后，大鼠以80mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭處死，分離海馬組織。正常組大鼠24h內(nèi)均未死亡，假手術(shù)組大鼠24h內(nèi)死亡1只，模型組大鼠24h內(nèi)死亡3只，治療組大鼠24h內(nèi)死亡2只；4組大鼠死亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。大鼠死亡后補(bǔ)充成活大鼠，保證每組12只。

1.2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取部分海馬組織，固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋，切取厚約4μm的超薄切片，行TUNEL檢測(cè)：（1）組織切片 60℃烤 2h；（2）二甲苯洗 5min×2 次；（3）分別使用無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇和70%乙醇洗 1 次，3min/次；（4）PBS 洗滌 5min×3 次，3%H2O2甲醇溶液處理 10min；（5）PBS 洗滌 5min×3 次，加入細(xì)胞通透液孵育 8min；（6）PBS 洗滌 5min×3 次，加入50μl TUNEL反應(yīng)混合液，濕盒和暗室中37℃孵育1h；（7）PBS洗滌 5min×3次，加入 50μl轉(zhuǎn)化-POD，濕盒中37℃孵育 30min；（8）PBS 洗滌 5min×3 次，二氨基聯(lián)苯胺法顯色，蘇木精復(fù)染 2～5min；（9）PBS 洗滌 5min×3 次；（10）分別使用70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和無水乙醇洗 1 次，3min/次；（11）二甲苯洗 5min×2 次；（12）封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞核染色呈棕黃色或棕紅色定義為細(xì)胞染色陽性；在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算10個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，總計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均陽性率（%）。

1.2.3 蛋白表達(dá)的檢測(cè) Western blot法檢測(cè)大鼠海馬組織原癌基因（c-fos）、pro-Caspase-3和 pro-Caspase-9蛋白表達(dá)。取部分組織按1∶10（密度：體積）加入細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，13 000g離心20min，收集上清液；BCA法測(cè)定蛋白濃度，等量蛋白（50μg）經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉（TBST）室溫封閉1h；加入相應(yīng)兔抗大鼠c-fos、pro-Caspase-3和 pro-Caspase-9單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST 洗膜 3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫?fù)u床孵育1h，TBST洗膜3次；ECL試劑作用5min，X線膠片曝光。沖洗并掃描后，結(jié)果用Quality One軟件分析雜交條帶灰度值，以磷酸甘油醛脫氫酶水平為內(nèi)參對(duì)照計(jì)算相對(duì)灰度值，即c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 蛋白活性的檢測(cè) 四肽熒光底物法檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9蛋白活性。取腦組織勻漿100μl和Caspase-3 底物（AC-DEVD-AMC）10μl，加入 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖液至 1ml，37℃孵育 1h；用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)380nm、釋放波長(zhǎng)460nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。取腦組織勻漿100μl和Caspase-9底物（AC-LEHD-AFC）10μl，加入 HEPES 緩沖液至 1ml，37℃孵育1h；用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)400nm、釋放波長(zhǎng)505nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。以未加腦組織時(shí)的熒光強(qiáng)度為參照計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，即Caspase-3和Caspase-9蛋白活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTY720對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響 正常組和假手術(shù)組大鼠凋亡的海馬神經(jīng)元比例分別為（7.5±0.40）%、（7.7±0.41）%，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組大鼠凋亡的海馬神經(jīng)元比例為（27.1±0.90）%，較正常組、假手術(shù)組均明顯升高（均P＜0.05）；治療組大鼠凋亡的海馬神經(jīng)元比例為（15.5±0.51）%，較模型組明顯下降（P＜0.05），見圖 1。

2.2 FTY720對(duì) c-fos、pro-Caspase-3和 pro-Caspase-9蛋白表達(dá)水平的影響 正常組與假手術(shù)組大鼠海馬組織c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；模型組較正常組、假手術(shù)組均明顯增加（均P＜0.05）；治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05），見表1和圖2。

圖1 FTY720對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響（×20）

表1 4組大鼠c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達(dá)水平比較（%）

圖2 4組大鼠c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達(dá)的電泳圖

2.3 FTY720對(duì)Caspase-3、Caspase-9蛋白活性的影響 正常組與假手術(shù)組大鼠海馬組織Caspase-3、Caspase-9蛋白活性比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；模型組較正常組、假手術(shù)組均明顯增加（均P＜0.05）；治療組較模型組均明顯下降（均P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠Caspase-3、Caspase-9蛋白活性比較（%）

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是腦動(dòng)脈瘤破裂的常見表現(xiàn)，出血導(dǎo)致的早期腦損傷會(huì)影響患者的預(yù)后[8-9]。免疫反應(yīng)是繼發(fā)性腦損傷病理、生理機(jī)制的重要組成部分，也參與蛛網(wǎng)膜下腔出血繼發(fā)的早期腦損傷過程。腦組織局部免疫反應(yīng)增強(qiáng)會(huì)加重腦組織的繼發(fā)性腦損傷[1-2]，為臨床應(yīng)用免疫抑制劑治療蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但臨床常規(guī)免疫抑制劑可導(dǎo)致全身免疫功能降低，繼發(fā)感染。因此，尋找一種安全、有效的免疫抑制劑對(duì)降低蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷具有重要意義。FTY720是一種新型的免疫抑制劑，是將冬蟲夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分ISP-I進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而成，屬于鞘氨醇-1-磷酸鹽受體阻滯劑[5]。FTY720在體外以無活性的形式存在，在體內(nèi)經(jīng)鞘氨醇激酶2磷酸化為具有生物活性的（S）-FTY720-P異構(gòu)體而發(fā)揮作用。FTY720主要用于抑制器官移植所引起的排斥反應(yīng)，還可用于治療皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂/障礙疾病及某些轉(zhuǎn)移性癌癥[3-7]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是較為復(fù)雜的病理、生理過程，涉及諸多信號(hào)通路和信號(hào)蛋白。c-fos蛋白是神經(jīng)細(xì)胞中常見的快速反應(yīng)蛋白，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、記憶和信息傳遞等過程。在出血、缺血、缺氧和創(chuàng)傷等刺激下，c-fos基因早期表達(dá)增加，與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)[10-11]。pro-Caspase-3、pro-Caspase-9 是凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的無活性前體形式，當(dāng)受到凋亡信號(hào)刺激后，會(huì)酶解成Caspase-3、Caspase-9活性二聚體形式。其中Caspase-3蛋白為凋亡執(zhí)行者，可直接降解胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡。而Caspase-9是凋亡啟動(dòng)者，受到凋亡信號(hào)刺激后，Caspase-9自剪接激活，引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)正常組、假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡不明顯，c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達(dá)亦不明顯，Caspase-3、Caspase-9活性不高；模型組大鼠神經(jīng)元凋亡比例明顯增加，c-fos、pro-Caspase-3和pro-Caspase-9蛋白表達(dá)明顯升高，Caspase-3、Caspase-9活性亦明顯增高。這提示以上生化指標(biāo)可在一定程度上反映神經(jīng)元凋亡程度。

目前FTY720用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中腦損傷治療的劑量均選用1mg/kg，一般在腦損傷動(dòng)物模型形成前短時(shí)間內(nèi)腹腔或靜脈注射[15-17]。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，神經(jīng)元凋亡一般在腦損傷后24～72h達(dá)到高峰[12-14]，且有關(guān)FTY720用于腦損傷治療的研究也一般選擇在腦損傷后24h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估和腦組織取樣[15-17]。基于以上因素，本研究在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型形成前短時(shí)間（0.5h）內(nèi)按1mg/kg腹腔注射FTY720治療腦損傷大鼠，且神經(jīng)元凋亡檢測(cè)的時(shí)間選擇在外傷后24h。另外，本實(shí)驗(yàn)期間有少量大鼠死亡，但4組大鼠死亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這保證了實(shí)驗(yàn)的均衡性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔注射FTY720后，大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡比例，c-fos、pro-Caspase-3和 pro-Caspase-9蛋白表達(dá)水平以及Caspase-3、Caspase-9蛋白活性均表現(xiàn)出不同程度的下降，提示FTY720可抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。最近研究表明FTY720可抑制體外培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子[18]，阻止腦外傷大鼠皮層炎性細(xì)胞聚集[19]，抑制動(dòng)物腦出血后腦內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[15]。FTY720也能明顯抑制短暫性腦缺血大鼠神經(jīng)元凋亡[16]，減輕腦出血大鼠腦水腫[17]。以上研究結(jié)果提示，F(xiàn)TY720對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)元凋亡的抑制作用可能與其抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720可用于治療大鼠腦缺血，且不會(huì)增加機(jī)體的細(xì)菌感染率[20]。這說明FTY720用于治療蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷是安全、可靠的。然而，藥效與用藥時(shí)間和劑量密切相關(guān)，這方面有待進(jìn)一步研究。