延胡索中海罌粟堿和去氫延胡索甲素制備工藝的研究

歐麗婷，丁 輝，呂菲菲，張朝鳳，張 勉，許翔鴻

(中國(guó)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院 生藥學(xué)研究室，江蘇 南京211198)

延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang) 的干燥塊莖，作為著名的浙江道地藥材“浙八味”之一，它是臨床上常用的中藥。其性辛溫味苦，無(wú)毒，具有活血、行氣、止痛的功效，為歷版《中國(guó)藥典》所收載[1]。

延胡索主要活性成分是異喹啉生物堿，母核類型多樣，主要的有原小檗堿(protoberberine)型如原小檗堿型的延胡索甲素(corydaline，Cor)、四氫巴馬汀(tetrahydropalmatine，THP即延胡索乙素)、去氫延胡索甲素(dehydrocorydaline，DHC)；普洛托品(protopine)型如原阿品堿(protopine)、阿樸菲型(aporphine) 如海罌粟堿(glaucine)[2]。其中多個(gè)生物堿已被開(kāi)發(fā)為不同作用的制劑，延胡索乙素在中國(guó)作為止痛藥[3]，去氫延胡索甲素作為抑制胃酸分泌的抗?jié)儎4]，以“Egnosin”的商品名在日本市場(chǎng)銷售[5]，海罌粟堿具有支氣管擴(kuò)張和抗炎作用[6]，自1967年開(kāi)始在羅馬尼亞和保加利亞等歐盟的一些國(guó)家用作鎮(zhèn)咳藥使用[7-8]。

基于延胡索不同生物堿單體的現(xiàn)實(shí)需求，需要開(kāi)發(fā)出一種快速簡(jiǎn)單、適合工業(yè)化生產(chǎn)單體化合物的方法，特別是已有臨床應(yīng)用的海罌粟堿和去氫延胡索甲素。傳統(tǒng)分離方法是基于研究目的的硅膠柱層析分離方法[9]，很難工業(yè)化生產(chǎn)；雖然有報(bào)道用高速逆流色譜法分離制備延胡索中的海罌粟堿和去氫延胡索甲素[10]，但是此方法工藝復(fù)雜，也無(wú)法量產(chǎn)。本文首次提出通過(guò)不同的pH梯度結(jié)合不同類型溶劑萃取，可以快速大量得到海罌粟堿和去氫延胡索甲素的方法。此方法適合于工業(yè)化生產(chǎn)海罌粟堿和去氫延胡索甲素，也適用于延胡索中其他結(jié)構(gòu)相似的生物堿工業(yè)化生產(chǎn)方法的開(kāi)發(fā)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260系列高效液相色譜儀(Agilent Technologies, USA)；AL104萬(wàn)分之一分析天平、XS105DU十萬(wàn)分之一分析天平(Mettler-Toledo Balances & Scales for Industry, Switzerland)；N-1100 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Tokyo Rikakikai, Co.,Ltd, Japan)；KH-500DE醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇常州國(guó)華儀器廠)；高速多功能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)。

延胡索甲素、延胡索乙素、去氫延胡索甲素和海罌粟堿對(duì)照品自制，純度大于99%(HPLC面積歸一化法)。延胡索藥材2016年購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)作者鑒定、導(dǎo)師核對(duì)為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖。甲醇為色譜純(美國(guó)TEDIA)，水為哇哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 延胡索提取方法

取延胡索藥材粉碎，用8倍量80%乙醇回流提取兩次，每次1.5 h。濾過(guò)，提取液合并，減壓濃縮得浸膏，干燥，備用。

2.2 HPLC含量測(cè)定色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；以0.15%乙酸銨水(A)-甲醇(B)為流動(dòng)相梯度洗脫： 0～3 min，維持45% B；3～15 min，45%～75% B；15～22 min，維持75% B；22～29 min，75%～85% B；29～34 min, 維持85% B；34～39 min，85%～95% B；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速1 mL /min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。(方法學(xué)考察略)

2.3 生物堿萃取方法

延胡索浸膏5 g用2%鹽酸200 mL充分溶解，離心(3000 r/min)10 min，取50 mL上清液用5%氫氧化鈉溶液分別調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H值(4、6、8、9、10)，用等倍量的有機(jī)溶劑(二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚)萃取3次，合并萃取液，回收溶劑，干燥，備用。精密稱取所制備的萃取物10 mg，置于10 mL 容量瓶中，加適量甲醇溶解并稀釋至刻度，超聲，搖勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各生物堿含量。

2.4 兩種生物堿結(jié)晶溶劑考察

取含有海罌粟堿或去氫延胡索甲素的萃取物，分別用多種有機(jī)溶劑溶解、重結(jié)晶，選擇適宜的結(jié)晶溶劑。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 pH梯度對(duì)生物堿萃取的影響

延胡索浸膏的酸水溶液，用5%氫氧化鈉溶液分別調(diào)pH值至4、6、8、9、10，然后用石油醚萃取。結(jié)果(圖1)表明，隨著pH的升高，萃取出的總生物堿分別占浸膏總生物堿的6.9%、54.2%、27.2%、40.6%和64.0%，pH值為6和10時(shí)的總堿萃取率最高。生物堿的含量測(cè)定結(jié)果表明，pH值為10時(shí)萃出的總堿部位中海罌粟堿含量最高，占浸膏中海罌粟堿總量的92.51%；pH值為6時(shí)，萃出的總堿中延胡索甲素和乙素的總量最高，占浸膏中兩者生物堿總量的82.90%；pH值從6→10，萃出的總堿中延胡索甲素和乙素的占比降低，海罌粟堿占比逐漸增高，因此pH 10為萃取海罌粟堿的最佳pH值。由圖1可見(jiàn)，萃取總堿中的主要生物堿為延胡索甲素、乙素和海罌粟堿，去氫延胡索甲素含量較低，據(jù)此采用分步連續(xù)萃取法：在pH 6時(shí)把延胡索甲素和延胡索乙素先萃取出來(lái)，將溶液調(diào)至pH 10萃取海罌粟堿，然后用二氯甲烷萃取去氫延胡索甲素。

DHC-去氫延胡索甲素，Glaucine-海罌粟堿;THP-延胡索乙素;Cor-延胡索甲素

3.2 萃取溶劑和次數(shù)對(duì)生物堿的影響

為了考察不同溶劑對(duì)生物堿萃取的影響，用5%氫氧化鈉溶液將浸膏酸水溶液分別調(diào)至pH 6或pH 10，分別用二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚萃取2次，測(cè)定各生物堿的含量，計(jì)算萃取率。結(jié)果(圖2A、2B)表明，無(wú)論在pH 6還是pH 10，二氯甲烷或乙酸乙酯可以將所有的生物堿都萃取出來(lái)，沒(méi)有選擇性；石油醚則具有較好的選擇性，pH 6時(shí)萃取的主要是延胡索甲素和乙素，pH 10時(shí)則海罌粟堿萃取率最高。萃取了延胡索甲素、乙素和海罌粟堿后的溶液，利用二氯甲烷無(wú)差別萃取的性質(zhì)將去氫延胡索甲素萃取出來(lái)。萃取次數(shù)的研究結(jié)果(圖2C、2D)表明，無(wú)論在pH 6還是pH 10，石油醚萃取1～3次，萃出的生物堿依次降低，2次的萃取率已在93%以上，從節(jié)約溶劑和時(shí)間的角度考慮，選擇萃取2次。

A、C：pH = 6；B、D：pH = 10

3.3 溶劑對(duì)生物堿重結(jié)晶的影響

取主含海罌粟堿和去氫延胡索甲素的萃取物，分別用乙酸乙酯、乙醇、甲醇溶解進(jìn)行重結(jié)晶。結(jié)果顯示，乙酸乙酯溶液中析出的海罌粟堿結(jié)晶純度為99.1%，甲醇中析出的去氫延胡索甲素結(jié)晶純度為99.5%。因此，選擇乙酸乙酯和甲醇分別為海罌粟堿和去氫延胡索甲素的重結(jié)晶溶劑。

3.4 兩種生物堿制備工藝的確定與驗(yàn)證

制備工藝確定如下：延胡索藥材粉末→8倍量80%乙醇回流提取兩次，每次1.5 h→濃縮干燥得浸膏→用2%鹽酸充分溶解，離心→上清液用5%氫氧化鈉調(diào)至pH 6→石油醚萃取2次后殘液調(diào)至pH 10→石油醚萃取2次，萃取液為海罌粟堿粗品→殘液用二氯甲烷萃取2次，萃取液為去氫延胡索甲素粗品。

取3份延胡索藥材粉末50 g，按照上述工藝平行操作，HPLC檢測(cè)，計(jì)算海罌粟堿和去氫延胡索甲素含量粗品的量，進(jìn)行工藝驗(yàn)證。將得到的海罌粟堿和去氫延胡索甲素粗品分別用乙酸乙酯和甲醇重結(jié)晶。結(jié)果表明，從3份樣品中得到的海罌粟堿分別為37.85、36.15、36.10 mg，RSD為2.71%，重結(jié)晶后純度分別為98.7%、99.0%、99.1%，RSD為0.21%；去氫延胡索甲素分別為31.10、32.00、33.55 mg，RSD值為3.85%，重結(jié)晶后純度分別為99.3%、99.2%、99.5%，RSD為0.15%；表明該工藝穩(wěn)定可靠。

4 討 論

本文通過(guò)對(duì)影響海罌粟堿和去氫延胡索甲素萃取的關(guān)鍵因素的研究，建立了一種快速簡(jiǎn)單適合工業(yè)化生產(chǎn)海罌粟堿和去氫延胡索甲素單體的方法。本文首次提出不同pH梯度結(jié)合不同溶劑的萃取方法，在除去雜質(zhì)以及非目標(biāo)化合物的同時(shí)，將延胡索提取物中所含的阿樸菲類生物堿海罌粟堿和原小檗堿型生物堿去氫延胡索甲素分別萃取，得到目的生物堿含量達(dá)到90%左右的萃取物，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的重結(jié)晶之后純度可以達(dá)到98%以上。該制備方法工藝簡(jiǎn)單、高效，回收率高，生產(chǎn)成本低，為這兩個(gè)生物堿的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的解決方案。