利用小麥胚芽制備GABA

季妮娜,姚鑫淼,*,管立軍,盧淑雯,高 揚(yáng),張英蕾,沈卉芳,王家有,張莉莉

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所,黑龍江哈爾濱 150086;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)化研究所,黑龍江哈爾濱 150086;3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所,黑龍江綏棱 152200)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸,在哺乳動(dòng)物和昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)中作為重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)存在,此外還存在于細(xì)菌、真菌、藻類、蕨類和一些高等植物當(dāng)中。高等植物組織中GABA的含量超過許多蛋白質(zhì)類氨基酸的含量,達(dá)到0.3～32.5 μmol·g-1[1]。研究表明,在人腦能量代謝過程中GABA起到了十分重要的作用,它具有激活腦內(nèi)葡萄糖代謝、促進(jìn)乙酰膽堿合成、降血氨、抗驚厥、降血壓、改善腦機(jī)能、精神安定、促進(jìn)生長激素分泌等生理作用,特別是在降血壓方面的作用[2]。因此大量GABA的強(qiáng)化保健食品應(yīng)運(yùn)而生,如含有GABA的茶及口服液等產(chǎn)品。由于GABA在動(dòng)植物原料中含量很低,很難從這些天然組織中大量提取到,目前GABA的制備主要分為化學(xué)法和生物法兩大類,其中生物法又包括微生物發(fā)酵法和植物制備法[3]?；瘜W(xué)方法合成GABA的工藝中使用的原料毒性大、價(jià)格昂貴、反應(yīng)條件苛刻、安全性較差和產(chǎn)物中有害物質(zhì)殘留嚴(yán)重等,不宜作為食品及飼料添加劑使用。而微生物發(fā)酵法具有操作條件溫和、成本低等特點(diǎn),但需要人員多、發(fā)酵周期長、工業(yè)化難度較大。因此本研究采用植物制備法,成本低,安全可靠,工藝簡單易控制[4]。

小麥胚芽是小麥制粉的副產(chǎn)物,富含多種營養(yǎng)成分,且價(jià)格低廉[5]。因此本實(shí)驗(yàn)以小麥胚芽及谷氨酸為原料,進(jìn)行GABA工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的主要原理是利用小麥胚芽中的谷氨酸脫羧酶與谷氨酸在吡哆素輔酶的催化下反應(yīng)生成高品質(zhì)、高濃度的GABA溶液。本研究的目的是開發(fā)出可以在食品中應(yīng)用的GABA,絕不是利用藥用GABA的簡單添加,而是要從制備這個(gè)源頭開始,利用天然物質(zhì)及采用生物技術(shù)方法,生產(chǎn)出可安全用于食品并可被視為天然添加劑的食用GABA。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥胚芽 山東省棗莊市農(nóng)家自產(chǎn),置于-30 ℃冰箱保存;吡哆素 純度>99%,湖南世紀(jì)華星生物工程有限公司生產(chǎn);純度為99%的食品級L-谷氨酸 無錫必康生物工程有限公司生產(chǎn)。

SHHW21.600AII型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;XS204型電子天平 Mettler Toledo分析儀器制造有限公司;UltiMate 3000液相色譜儀 美國賽默飛世爾公司;離心機(jī) SIGMA公司;QT-1旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司;XS204分析天平(0.0001 g) 梅特勒-托利。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GABA的制備方法 分別稱取谷氨酸、小麥胚芽、吡哆素,再加入蒸餾水,將反應(yīng)液放入水浴鍋中加熱,用電動(dòng)攪拌器進(jìn)行攪拌,由于反應(yīng)過程中會消耗部分吡多素,因此反應(yīng)每隔1 h后追加100 mg的吡哆素[1]。反應(yīng)過程中利用緩沖液控制反應(yīng)液的pH為6,結(jié)束后5000 r/min,離心10 min后取上清液。

1.2.2 GABA生成量的測定 采用高效液相色譜法(HPLC)[6-10]。

HPLC色譜條件如下:色譜柱采用C18柱,250 mm×4.6 mm,5 μm;紫外檢測器,檢測波長436 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相采用乙腈與三水合乙酸鈉混合溶液(v:v=35%:65%),流速1.0 mL/min。

樣品衍生化:準(zhǔn)確吸取1 mL試樣溶液或標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于具塞試管中,加入0.20 mL濃度為0.04 g/mL的碳酸氫鈉溶液和0.4 mL濃度為3 mg/mL的4-二甲基氨基偶氮苯-4-磺酰氯衍生試劑,混勻后在70 ℃水浴中衍生反應(yīng)20 min,用微孔濾膜過濾,待測。

GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:精確稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用乙腈溶液溶解并定容至10 mL,即為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。在使用中將標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液逐級稀釋成2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg/L。以濃度為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到曲線方程y=735.5713x+158.2493(R2=0.9993)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 谷氨酸添加量對GABA生成量的影響 取250 g小麥胚芽,添加100 mg吡哆素,在反應(yīng)溫度40 ℃、pH在5.0的條件下反應(yīng)4 h?？疾旃劝彼崽砑恿?0、80、100、120、140 g/L對GABA生成量的影響。

1.2.3.2 反應(yīng)時(shí)間對GABA生成量的影響 取250 g小麥胚芽,添加100 mg吡哆素,在谷氨酸添加量為60 g/L、反應(yīng)溫度40 ℃、pH在5.0的條件下考察反應(yīng)時(shí)間1、2、3、4、5、6、7 h對GABA生成量的影響。

1.2.3.3 反應(yīng)液的pH對GABA生成量的影響 取250 g小麥胚芽,添加100 mg吡哆素,在谷氨酸添加量為60 g/L、反應(yīng)溫度40 ℃的條件下反應(yīng)4 h,考察反應(yīng)液的pH4.0、4.5、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.5、7.0時(shí)GABA的生成量。

1.2.3.4 GABA制備溫度對生成量的影響 取250 g小麥胚芽,添加100 mg吡哆素,在谷氨酸添加量為60、80、100、120、140 g/L pH在5.0的條件下反應(yīng)4 h,考察反應(yīng)溫度30～50 ℃對GABA生成量的影響。

1.2.4 中心組合實(shí)驗(yàn) 采用中心組合設(shè)計(jì)(CCD)響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化小麥胚芽制備GABA的條件。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,對影響GABA生成量的四個(gè)因素即谷氨酸添加量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)液pH、反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化[12-13]。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in the response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)過程中,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,應(yīng)用Origin 7.0軟件作圖[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 谷氨酸添加量對GABA生成量的影響 由圖1可以看出,GABA的生成量隨谷氨酸的添加量的增加先上升后下降,在添加量為100 g時(shí),GABA的生成量達(dá)到峰值。而添加量大于100 g時(shí),GABA的生成量隨谷氨酸添加量的增加而降低。且添加量為100 g時(shí),GABA的生成量達(dá)到33.9 mg/L,但隨著添加量的不斷增多反應(yīng)液會出現(xiàn)小麥蛋白深層發(fā)酵產(chǎn)生的不愉快的氣味[12,16],在反應(yīng)液搜集時(shí)不愉快的氣味也沒有消失。因此在考慮到原料的利用率及反應(yīng)液的安全性上[13],谷氨酸的添加量為100 g時(shí)得到最大的生成量,能充分地利用谷氨酸產(chǎn)生大量的GABA。

圖1 谷氨酸添加量對GABA生成量影響Fig.1 Effect of the amount of glutamic acid added on production of GABA

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對GABA生成量的影響 由圖2可以看出隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,GABA生成量快速增加;在反應(yīng)4 h以后GABA的生成量增加趨于平緩。繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間,GABA的生成量增加趨于平緩。這可能是因?yàn)镚ABA的大量制備影響了谷氨酸與谷氨酸脫羧酶在吡哆素催化下的反應(yīng)[15]。但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過4 h后,由于雜菌的作用使反應(yīng)液顏色變深并會發(fā)出不愉快的氣味[18]。作為制作食品的原料,反應(yīng)時(shí)間超過4 h的反應(yīng)液并不適合加入到食品中去,所以得出適宜的反應(yīng)時(shí)間為4 h。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對GABA生成量的影響Fig.2 Effect of reaction time on production of GABA

2.1.3 反應(yīng)液的pH對GABA生成量的影響 從圖3中可以看出GABA的生成量隨pH的變化呈現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。當(dāng)pH為5.8時(shí)生成量達(dá)到峰值。分析此變化的原因應(yīng)該是,谷氨酸脫羧酶活性隨著pH的增大而增強(qiáng)[17],達(dá)到適宜pH時(shí)活性最強(qiáng)。超過了最適pH時(shí),谷氨酸脫羧酶活性與pH成反比,隨著pH的增大而減弱,因此可以確定反映的適宜pH為5.8。

圖3 pH對GABA生成量的影響Fig.3 Effect of pH on production of GABA

2.1.4 反應(yīng)液的溫度對GABA生成量的影響 從圖4中可以看出,GABA的生成量隨著反應(yīng)溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,且在溫度為40 ℃時(shí)達(dá)到峰值。這說明谷氨酸脫羧酶的適宜溫度在40 ℃。在40 ℃之前,谷氨酸脫羧酶的活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)[18]。尤其在35～40 ℃之間,谷氨酸脫羧酶的活性隨溫度的上升而快速增強(qiáng)。當(dāng)溫度超過40 ℃時(shí),谷氨酸脫羧酶活性明顯降低,所以由此可以確定谷氨酸脫羧酶適宜溫度為40 ℃。

圖4 溫度對GABA生成量的影響Fig.4 Effect of temperature on production of GABA

2.2 小麥胚芽制備GABA的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 預(yù)測模型建立 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 小麥胚芽制備GABA中心組合實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Central composite design matrix of enriched GABA use

根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,建立GABA生成量的二次響應(yīng)回歸模型為:

對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis for regression equation

圖5 谷氨酸添加量與pH響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour of the interaction with the amount of glutamic acid added and pH

圖6 谷氨酸添加量與反應(yīng)溫度響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour of the interaction with the amount of glutamic acid added and temperature

圖7 谷氨酸添加量與反應(yīng)時(shí)間響應(yīng)面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour of the interaction with the amount of glutamic acid added and reaction time

圖8 pH與反應(yīng)溫度響應(yīng)面及等等高線圖Fig.8 Response surface and contour of the interaction with the temperature and pH

圖9 pH與反應(yīng)時(shí)間響應(yīng)面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour of the interaction with reaction time and pH

圖10 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間響應(yīng)面及等高線圖Fig.10 Response surface and contour of the interaction with reaction time and temperature

2.2.3 最佳工藝的確定及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程,利用Designexpert軟件獲得了小麥胚芽制備GABA生成量最高時(shí)的工藝條件為谷氨酸的添加量為80 g,pH維持在5.6并在40 ℃下反應(yīng)4 h,預(yù)測計(jì)算得到的GABA的生成量為36.12 mg/L。為了驗(yàn)證其優(yōu)化結(jié)果的可靠性,在最佳工藝條件下進(jìn)行5組平行實(shí)驗(yàn),測得GABA生成量分別為平均值為(35.42±2.19) mg/L,由回歸方程預(yù)測所得到GABA最高生成量與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測得的平均值相接近,說明該模型能夠較好地預(yù)測GABA生成量。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以谷氨酸添加量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)液pH、反應(yīng)溫度為自變量,生成GABA的量為響應(yīng)值,通過SPS 9.1軟件,運(yùn)用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到了回歸模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠較好的擬合,自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系較為顯著,有一定的應(yīng)用價(jià)值。優(yōu)化驗(yàn)證后得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為向250 g新鮮的小麥胚芽中添加谷氨酸的量為80 g/L,反應(yīng)液的pH為5.6,反應(yīng)溫度為40 ℃,持續(xù)反應(yīng)4 h,所能得到GABA的生成量為(35.42±2.19) mg/L。由于此反應(yīng)是食物來源生成的GABA較工業(yè)化學(xué)合成的安全可靠,且作為原料的小麥胚芽價(jià)格低廉,可將生成的GABA作為添加劑添加到食品中。