泡菜中抑菌性芽孢桿菌的篩選及其細菌素理化特性

張紅梅,符丹丹,趙君峰,王大紅,李市場,張 敏

(河南科技大學食品與生物工程學院,洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,河南科技大學微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室,河南洛陽 471023)

隨著人們對食品品質(zhì)和食品安全要求的提高,食品中致病微生物和腐敗微生物的控制顯得越來越重要。近年來,由于人們對食品添加劑的安全性考慮,食品添加劑的使用量一直在減少,而生物保鮮成為大家關(guān)注的焦點。生物保鮮是化學添加劑的替代技術(shù),它利用天然微生物產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)達到延長食品保質(zhì)期的目的[1]。來自于乳酸菌(LAB)具有抑菌活性的細菌素,已經(jīng)成人們廣泛研究的對象[2]。然而,關(guān)于產(chǎn)生細菌素的芽孢桿菌研究較少,既然芽孢桿菌屬細菌能夠產(chǎn)生多種不同化學結(jié)構(gòu)的抗菌多肽,對產(chǎn)細菌素的芽孢桿菌的研究顯得更有意義[3]。

國內(nèi)外學者從不同的環(huán)境中分離篩選了產(chǎn)細菌素的芽孢桿菌。如Cladera-Olivera等[4]從亞馬遜河中分離到1株能抑制單增李斯特氏菌的地衣芽孢桿菌;Liu等[5]從傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離到1株產(chǎn)分子量為3.5 kD細菌素的枯草芽孢桿菌;An等[6]從海洋石斑魚中篩選到一株抑制多數(shù)食源性病原菌的解淀粉芽孢桿菌;李俊峰等[7]從石油污染的土壤中篩選到一株產(chǎn)細菌素物質(zhì)的枯草芽孢桿菌。

研究發(fā)現(xiàn),自然發(fā)酵泡菜在常溫下長期保存不易變質(zhì)的主要原因除了其低pH外,還有生產(chǎn)過程中某些微生物產(chǎn)生的能抑制其他細菌生長的抑菌物質(zhì)[8]。為獲得結(jié)構(gòu)新穎、抑菌活性更為穩(wěn)定的細菌素,本文擬從市售袋裝泡菜中分離篩選具有廣譜抑菌作用的芽孢桿菌菌株,進而為生物保鮮新品種的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜:采自云南通?？h泡椒小米辣、河北平鄉(xiāng)縣泡豇豆,四川眉山酸菜,烏江涪陵榨菜;大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、釀酒酵母菌(Saccharomyceteceevisiae)AS2399、納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)4.3505 均由河南科技大學食品與生物工程學院微生物實驗室保藏;實驗動物:一級小白鼠(體重18～22 g) 購自第四軍醫(yī)大學;LB肉湯 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;木瓜蛋白酶(200000 U/g)、胰蛋白酶(250000 U/g)、鏈霉蛋白酶(200000 U/g)、淀粉酶(200000 U/g)和脂肪酶(200000 U/g) 華藍化學有限公司;rTaq PCR Master mix 上海生工生物工程股份有限公司;細菌基因組DNA快速抽提試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺 蘇州安凈凈化科技有限公司;DH-420型恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司;H2100R臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;THZ-Q恒溫振蕩器 太倉市華美生化儀器廠;ABI stepone plus PCR儀 德國艾本德股份有限公司;EDZX-50K立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢桿菌的篩選 取4種泡菜汁各2 mL,混勻后于70 ℃水浴中孵育30 min,殺死營養(yǎng)細胞,梯度稀釋后,取100、10-1、10-2三個梯度均勻涂布于LB肉湯培養(yǎng)基,觀察細菌菌落的形態(tài)特征,對疑似菌落進行革蘭氏染色[9],挑取產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌落保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌素產(chǎn)生菌株的初步篩選 將分離的菌株于LB肉湯液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)36 h,發(fā)酵液經(jīng)8000 r/min離心10 min,取上清液,采用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾除菌去除菌體,獲得拮抗液。利用瓊脂擴散法測定抑菌活性[10],取大腸桿菌培養(yǎng)液(細菌濃度1.0×106CFU·mL-1)均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面,于每個孔中加入100 μL拮抗液,培養(yǎng)24 h,觀察抑菌作用,記錄抑菌圈直徑。

1.2.3 H2O2作用的排除 H2O2作用的排除參照張艾青等[11],利用H2O2受熱分解的特性,取菌株拮抗液于80 ℃水浴加熱10 min,參照1.2.2測定除去H2O2的拮抗液對大腸桿菌的抑菌直徑。

1.2.4 蛋白酶的處理 取排除H2O2作用的拮抗液,分別加入木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶,使酶的終濃度為2 mg/mL,在酶的最適pH下,37 ℃保溫2 h,再將pH調(diào)回至6.5±0.2,以不加酶液的拮抗液作為對照,參照1.2.2測定蛋白酶和非蛋白酶處理后拮抗液對大腸桿菌的抑菌直徑。

1.2.5 菌株鑒定 對LB平板上培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)、色澤、表面、邊緣、凹凸度、透明度進行形態(tài)觀察;之后分別對菌體進行革蘭氏染色和芽孢染色后,于光學顯微鏡下觀察染色后的菌體形態(tài)和芽孢形狀。根據(jù)生理生化細菌鑒定標準,對分離純化后的菌株進行生理生化測定,包括硝酸鹽還原,淀粉水解,過氧化氫酶實驗,甲基紅實驗(M.R實驗)、H2S實驗及乙酰甲基甲醇實驗(V.P實驗)等[12]。

1.2.6 細菌16S rDNA基因序列測定 基因組DNA的提取方法參照Giorgio[13]。PCR擴增16S rDNA基因序列PCR擴增的引物分別是27F(5′-AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACC TTGTTACGACTT-3′)[14]。16S rDNA的測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。同源性分析利用BLAST,尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種,然后從GENEBANK中提取該屬內(nèi)的代表菌株的16S rDNA序列,與測定的菌株的序列共同用Clustal X1.8 校準對齊后,用MEGA5軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹[15]。

1.2.7 安全性實驗 取健康小鼠(體重18～22 g),隨機分組,每組5只。實驗組每只小鼠以腹腔注射的方法,分別注入菌體濃度為5×109個/mL的液體培養(yǎng)物1 mL;對照組每只小鼠腹腔注射1 mL生理鹽水,連續(xù)觀察7 d。

1.2.8 溫度和pH對細菌素的影響

1.2.8.1 溫度對細菌素的影響 菌體培養(yǎng)物以1%的接種量接入50 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)36 h,取拮抗液分別于70、80、90 ℃水浴中處理30 min,冷卻后,參照1.2.2測定拮抗液對大腸桿菌和酵母菌的抑菌直徑。

1.2.8.2 pH對細菌素的影響 菌體培養(yǎng)物以1%的接種量接入50 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)36 h,獲得拮抗液,用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)其pH分別至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,37 ℃保持2 h后,再將不同樣品的pH調(diào)回至6.5±0.2,參照1.2.2測定拮抗液對大腸桿菌的抑菌直徑。

1.2.9 細菌素抑菌譜 以大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、酵母菌(Saccharomycete)、鏈霉菌(Streptomyces)做指示菌,活化24 h后,稀釋至1.0×106CFU·mL-1,涂布接種于各對應的固體培養(yǎng)基表面,參照1.2.2測定拮抗液對各指示菌的抑菌直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.0進行實驗數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)平行3次,結(jié)果用平均值±標準偏差表示,采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌菌株的篩選

利用高溫水浴殺死營養(yǎng)細胞體的方法,從4種市售泡菜中共分離出3株產(chǎn)芽孢細菌,通過革蘭氏染色和芽孢染色后,發(fā)現(xiàn)這3株菌同時具有革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢、桿狀細胞的特點,初步確定這3株菌屬芽孢桿菌屬細菌,分別命名為PC-1、PC-2、PC-3。

2.2 細菌素產(chǎn)生菌株的初步篩選

利用瓊脂擴散法,以大腸桿菌為指示菌,對傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離的3株芽孢桿菌屬細菌PC-1、PC-2、PC-3進行抑菌活性檢測,結(jié)果如圖1所示。由圖1可見,PC-1對大腸桿菌沒有抑制作用,無抑菌圈出現(xiàn);PC-2和PC-3對大腸桿菌有抑制作用,均能形成抑菌圈,抑菌圈直徑分別為(33±0.23) mm和(30±0.37) mm;其中PC-2的抑菌抑菌作用強于PC-3,因此選用PC-2菌株作為進一步實驗的測試菌。

圖1 初篩菌株對指示菌的抑菌作用Fig.1 Antimicrobial effect of the primary strains

2.3 H2O2抑菌作用的排除

細菌生長代謝過程所產(chǎn)有機酸、H2O2以及菌體細胞常常也具有抑菌作用,初步篩選的PC-2需進一步確定其抑菌活性是否為細菌素所致。由于拮抗液的制作過程包含過濾除菌環(huán)節(jié),故排除菌體細胞的干擾;另外,拮抗液的pH在發(fā)酵前后無明顯變化為6.5±0.2,亦排除酸的影響;進一步通過加熱拮抗液使H2O2分解的方法,檢測H2O2對拮抗液抑菌的干擾作用,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,排除H2O2作用的拮抗液仍具有抑菌作用,平均抑菌圈直徑為(31±0.71) mm,與處理前抑菌效果差別不顯著,可以初步判斷PC-2的抑菌活性物質(zhì)不是H2O2。

圖2 H2O2排除后的抑菌作用Fig.2 Antimicrobial effect of Bacillus PC-2 after eliminating H2O2

2.4 蛋白酶的穩(wěn)定性

為進一步確定PC-2的抑菌活性物質(zhì),分別用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶對拮抗液進行處理,抑菌結(jié)果見圖3。圖3顯示,拮抗液中加入不同蛋白酶后,與對照相比抑菌圈直徑減小,抑菌活性均有不同程度降低;而用非蛋白水解酶淀粉酶和脂肪酶處理后,抑菌圈直徑變化不顯著,抑菌活性幾乎不受影響。其中,木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對拮抗液抑菌活性的影響較小,抑菌圈直徑分別減少了19.35%和22.58%,與對照組呈顯著性差異(p<0.05),鏈霉蛋白酶對其抑菌活性的影響較大,抑菌圈直徑減少了66.21%。從酶處理的結(jié)果來看,說明PC-2所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為蛋白類的細菌素物質(zhì),其中不含糖苷鍵和酯鍵。由于細菌素的氨基酸組成特征不同,造成細菌素對蛋白酶的敏感型不同,與Khochamit等[16],Zheng等[17]的研究結(jié)果相似。

圖3 蛋白酶對抑菌作用的影響Fig.3 Effect of proteolytic enzyme on the activitiy of bacteriocin from Bacillus PC-2

2.5 菌株鑒定

2.5.1 菌株P(guān)C-2菌體形態(tài)學觀察 菌株P(guān)C-2經(jīng)革蘭氏染色為陽性,光學顯微鏡下菌體呈明顯的直桿狀、單生,產(chǎn)橢圓形芽孢、中生,結(jié)果見圖4A;平板上菌落扁平,乳白色,粗糙褶皺,邊緣不整齊,結(jié)果見圖4B,具有典型的芽孢桿菌形態(tài)特征。

圖4 菌株P(guān)C-2的形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristic of train PC-2

2.5.2 生理生化特征 菌株P(guān)C-2的生理生化測定結(jié)果見表1。由表1可知,菌株P(guān)C-2能還原硝酸鹽、水解淀粉且具有液化明膠的能力等。根據(jù)鑒定結(jié)果查表,并結(jié)合革蘭氏染色觀察結(jié)果,可初步確定PC-2菌株屬于蠟樣芽孢桿菌(Bacillus.cereus)。

表1 芽孢桿菌PC-2的生理生化特征Table 1 Biochemical characteristic of Bacillus PC-2

2.5.3 細菌16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 測試菌株P(guān)C-2經(jīng)擴增電泳后得到約1483 bp的序列。將測序結(jié)果輸入Genebank中,利用Blast功能對目的序列與Genebank庫中的數(shù)據(jù)序列進行同源性比對。Clustal X 1.8對齊后使用MEGA 5.0計算序列相似性,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)育樹結(jié)果見圖5。軟件進行序列分析后,菌株P(guān)C-2與同源性搜索后關(guān)系最近的前2株來自蠟樣芽孢桿菌的親緣性最高,與菌株Bacillus.cereusaST307(其登錄號為:EU350369.1)處于同一個小分支,親緣關(guān)系最接近。結(jié)合菌落形態(tài)學特征和生理生化鑒定結(jié)果,菌株P(guān)C-2被鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus.cereus)。

圖5 菌株P(guān)C-2的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Developmental phylogenetic tree of PC-2 based on 16S rDNA

2.5.4 安全性實驗 注射菌液組和對照組小鼠在觀察期內(nèi)生長正常,未出現(xiàn)死亡及異常表現(xiàn),表明PC-2菌株沒有致病性,為安全無毒株。

2.6 溫度和pH對細菌素的影響

2.6.1 溫度對細菌素的影響 經(jīng)過不同溫度處理后,菌株P(guān)C-2拮抗液的抑菌活性變化結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,菌株P(guān)C-2的拮抗液經(jīng)70、80、90 ℃處理30 min后,對大腸桿菌的抑菌活性基本無影響,抑菌圈直徑保持在(32±0.56) mm范圍內(nèi);對酵母菌的抑菌活性也無明顯影響,抑菌圈直徑保持在(30±0.36) mm范圍內(nèi),表明PC-2所產(chǎn)細菌素有較強的熱穩(wěn)定性。據(jù)報道,芽孢桿菌屬細菌產(chǎn)生的細菌素特性與本結(jié)果一致,枯草芽孢桿菌BS15產(chǎn)生的細菌素80 ℃加熱30 min仍保持抑菌活性[18];蠟樣芽孢桿菌SS28和NS02所產(chǎn)細菌素,分別于121 ℃、100 ℃加熱15 min仍然穩(wěn)定[19-20];從蜂蜜中分離的抑制幼蟲芽孢桿菌的蠟樣芽孢桿菌m6c和m387產(chǎn)生的細菌素在70 ℃維持30 min仍活性穩(wěn)定[14]。

圖6 溫度處理對抑菌效果的影響Fig.6 Effect of temperature on the activitiy of bacteriocin from Bacillus cereus PC-2

2.6.2 pH對細菌素的影響 不同pH條件下菌株P(guān)C-2的拮抗液對大腸桿菌的抑菌活性變化情況如圖7所示,由圖7可知,PC-2所產(chǎn)細菌素在相對較寬的pH范圍(pH2.0～8.0)內(nèi)抑菌活性穩(wěn)定,pH9.0～11.0的堿性環(huán)境中抑菌活性微弱。在pH5.0的酸性條件下抑菌活性最強,低于或高于此值的偏酸或偏堿環(huán)境時,抑菌活性會不同程度遞減。pH2.0的偏酸環(huán)境時,抑菌活力減少到72.73%,pH8.0的偏堿環(huán)境中,抑菌活力減少到50.16%。偏堿環(huán)境下的抑菌效果弱于偏酸環(huán)境下的抑菌效果,這可能與偏酸性的泡菜汁環(huán)境有關(guān)。

圖7 pH對抑菌效果的影響Fig.7 Effect of pH on the activitiy of bacteriocin from Bacillus cereus PC-2

相似研究結(jié)果多有報道,Khalil等[21]報道了巨大芽孢桿菌22所產(chǎn)細菌素在pH2～8范圍內(nèi)對鼠傷寒沙門氏菌具有抑菌活性,Naclerio等[22]報道了蠟樣芽孢桿菌所產(chǎn)細菌素在3.0～12.0范圍內(nèi)活性均穩(wěn)定。細菌素的這一特性有利于其在酸性、中性及弱堿性食品中作為防腐劑的使用。

2.7 細菌素抑菌譜

通過瓊脂擴散法檢測菌株P(guān)C-2的拮抗液對多種指示菌的抑菌活性,結(jié)果見圖8。抑菌譜實驗結(jié)果表明,該拮抗液具有抑菌作用,且抑菌譜較廣,對G+菌(如金黃葡萄球菌)和G-菌(如大腸桿菌)均有抑菌作用,抑菌圈直徑均在(32±0.76) mm范圍;對單細胞真菌類(如酵母菌)和放線菌(如鏈霉菌)也有一定的抑制作用,抑菌圈直徑分別為(21±0.57) mm和(16±0.38) mm;表明菌株P(guān)C-2所產(chǎn)細菌素對細菌的抑制作用比對真菌的明顯,對真菌的抑制作用比對放線菌的明顯。蠟樣芽孢桿菌PC-2所產(chǎn)細菌素對食品污染常見菌的抑制作用更有利于其在生物保鮮方面的應用。

圖8 蠟樣芽孢桿菌PC-2所產(chǎn)細菌素的抑菌譜Fig.8 Inhibition spectrum of bacteriocin produced by Bacillus.cereus PC-2

3 結(jié)論

從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中篩選得到1株對大腸桿菌具有明顯抑菌作用的芽孢桿菌菌株P(guān)C-2,經(jīng)生理生化和16S rDNA鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus.cereus),pH2.0～8.0范圍內(nèi)抑菌活性穩(wěn)定,pH5.0時抑菌活性最強,該菌的抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性好。菌株的拮抗液經(jīng)不同蛋白酶處理后,抑菌活性均有降低,初步推測抑菌活性物質(zhì)為細菌素類。該抑菌物質(zhì)具有較廣泛的抑菌譜,為生物保鮮行業(yè)的廣泛應用奠定了基礎(chǔ)。