熱變性對(duì)海參腸酶解物活性的影響

姜 卉,金文剛,許景光,吳海濤,王笑涵,商文慧,韓佳潤(rùn),唐 越,*

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116034;2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西漢中 723001)

海參(Stichopusjaponicas)屬棘皮動(dòng)物門,海參綱,是一類重要的海洋無脊椎動(dòng)物。海參是一種傳統(tǒng)的海洋來源食品,同時(shí)也是重要的藥物資源,深受亞洲各國(guó)消費(fèi)者的喜愛[1]。相關(guān)研究表明,海參體內(nèi)含有較多如多糖[2]、皂苷[3]、萜甙[4]、脂肪酸[5]、多肽[6]等利于人體健康的成分,具有抗炎、抗過敏[3]、抗真菌[4]、提高免疫力[5]、降血壓[6]、延緩衰老和防治腫癌[7]等作用。

海參制品主要以海參體壁為加工對(duì)象,海參腸大多數(shù)被直接丟棄,不僅對(duì)環(huán)境造成了污染,還浪費(fèi)了蛋白質(zhì)資源,附加值較低[8]。隨著人們對(duì)海洋生物資源認(rèn)識(shí)的提高,從海洋中獲得食品蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì),利用酶制劑加工海產(chǎn)品副產(chǎn)物,制備蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和多肽,獲得功能性食品原料等,已成為各國(guó)進(jìn)行海洋資源開發(fā)利用的重要項(xiàng)目[9],例如非洲鯰魚抗菌肽[10],巴沙魚皮血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽[11]等,相關(guān)研究還討論了預(yù)處理對(duì)鳙魚水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響[12],但對(duì)于海參腸活性肽的研究仍屬少數(shù)。

本課題組前期已對(duì)海參腸進(jìn)行了一定的研究,主要集中在對(duì)海參腸中各種酶類進(jìn)行分離純化,如β-1,3-葡聚糖酶[13],溶菌酶[14],海參自溶酶[15]和組織蛋白酶B[16]等,探究多種海參腸內(nèi)源酶的特性及其對(duì)海參自溶的影響,但并未研究外源酶對(duì)海參腸的影響。本研究以海參腸為原料,結(jié)合熱變性預(yù)處理,選用中性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解,制備海參腸活性多肽,為海洋來源生物活性物質(zhì)的進(jìn)一步擴(kuò)展研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海參腸 大連長(zhǎng)興水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng);中性蛋白酶(酶活370000 U/g) 南寧龐博生物制藥有限公司;Sephadex G-25葡聚糖凝膠 Pharmacia公司;還原型谷胱甘肽(GSH)、肽分子量標(biāo)準(zhǔn)品:18肽(2342 Da) 西安聯(lián)美生物科技有限公司;維生素B12(1355 Da)、N-Hippuryl-His-Leu(430 Da) Sigma公司;細(xì)胞色素C(12500 Da)、抑肽酶(6512 Da) 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;其余試劑 為國(guó)產(chǎn)分析純。

KDN-103F型自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;SZF-106A型粗脂肪測(cè)定儀 上海新嘉電子有限公司;pHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;P230p型高效液相色譜 大連依利特分析儀器有限公司;UV2100型紫外可見分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;SuperdexTM Peptide 10/300GL凝膠柱(10 mm×300 mm) GE Healthcare公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海參腸化學(xué)組成分析 將海參腸洗凈后勻漿,取部分勻漿液凍干,對(duì)勻漿液(濕基)和海參腸凍干粉(干基)分別采用常規(guī)干燥法、凱氏定氮法、索氏提取法測(cè)定海參腸樣品的水分、蛋白質(zhì)以及脂肪含量[17],采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[18],參照標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0126x-0.0182(R2=0.9928)進(jìn)行分析;還原糖含量采用DNS法測(cè)定,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.001x+0.001(R2=0.9994)進(jìn)行分析;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品均為葡萄糖。

1.2.2 酶解物制備 海參腸經(jīng)勻漿處理,加去離子水使其質(zhì)量濃度為4%(w/v),沸水浴10 min(變性處理組),實(shí)驗(yàn)中以未經(jīng)沸水浴處理的樣品為對(duì)照(未變性處理組)。根據(jù)課題組的前期研究[19],選用中性蛋白酶為外源酶,變性處理和未變性處理兩組分別用HCl和NaOH溶液調(diào)pH至7.0后,加酶(3000 U·g-1pro.)在50 ℃水浴條件下,兩組樣品均恒溫酶解3 h,沸水浴10 min滅酶,4000 r/min離心15 min后取上清液,-25～-50 ℃條件下真空冷凍干燥60～72 h。

1.2.3 水解度測(cè)定 參照pH-stat法[20],通過控制標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的滴加量進(jìn)行水解度的測(cè)定,取水解5、10、20、40、60、80、100、130、160、180 min的樣品,記錄對(duì)應(yīng)的NaOH溶液消耗量,計(jì)算水解度,公式如下:

式中:DH-水解度,%;B-滴定過程消耗堿液量,mL;Nb-堿的當(dāng)量濃度,mol/L;Mp-底物中蛋白總量,g;htot-底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù),mmol/g,計(jì)算時(shí)取值為7.5;α-水解過程中α-氨基的解離度。

1.2.4 酶解液中可溶蛋白、三氯乙酸(TCA)可溶性寡肽含量和肽得率的測(cè)定 將經(jīng)變性預(yù)處理和未變性處理的海參腸酶解液去離子水稀釋20倍后,選用考馬斯亮藍(lán)G-250法對(duì)兩組海參腸酶解液的可溶性蛋白含量進(jìn)行測(cè)定[18],通過相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。采用TCA沉淀法結(jié)合Folin-酚法檢測(cè)酶解液中TCA可溶性寡肽的含量[21],根據(jù)繪制的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0035x+0.00128(R2=0.9977),參照文獻(xiàn)[21]對(duì)肽得率進(jìn)行計(jì)算,公式如下:

式中:N1-酶解液中TCA可溶性寡肽含量,mg;N0-酶解液總蛋白量,即酶解液中底物蛋白量,mg。

1.2.5 海參腸酶解液層析分離 采用Sephadex G-25凝膠層析柱(1.6 cm×50 cm),海參腸酶解液上樣量0.5 mL,用去離子水進(jìn)行洗脫,流速為0.25 mL/min,采用部分收集器每次收集40管,作為待測(cè)樣品。

1.2.6 樣品蛋白質(zhì)含量及還原能力的測(cè)定 蛋白含量的測(cè)定采用紫外分光光度法,測(cè)定其在280 nm下的吸光度(OD280)[22]。還原能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行:取層析分離收集到的樣品溶液1 mL,經(jīng)過一系列反應(yīng)后測(cè)定OD700,空白組為去離子水。

1.2.7 變性處理組樣品分子量分布的測(cè)定 將變性處理組海參腸酶解液用去離子水稀釋5倍,經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾,采用Superdex Peptide 10/300GL(10 mm×300 mm)凝膠過濾色譜柱進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定分子量分布范圍。具體方法參考文獻(xiàn)[22]進(jìn)行:進(jìn)樣量:50 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;洗脫流量:0.5 mL/min。分子量標(biāo)準(zhǔn)品分別選用Cytochrome C(12.5 kDa),Aprotinin(6.512 kDa),18肽(2.342 kDa),Vitamin B12(1.355 kDa)和N-Hippuryl-His-Leu(0.43 kDa)和gly-gly(0.132 kDa)。對(duì)凝膠過濾色譜而言,分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(y)與保留時(shí)間(x)呈線性關(guān)系,從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.0834x+5.7554(R2=0.9944),計(jì)算海參腸酶解液的分子量分布。

1.2.8 變性處理組海參腸多肽的ABTS+自由基清除率檢測(cè) 以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體操作步驟如下:準(zhǔn)確稱量0.05006 g Trolox,加入40 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH7.4)。將其用PBS(0.2 mol/L,pH7.4)稀釋,使?jié)舛忍荻葹?0、1、2、3、4、5 mmol/L,分別取10 μL與稀釋好的1 mL ABTS+·溶液在30 ℃干浴器中反應(yīng)6 min,在734 nm下測(cè)定吸光值,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=19.008x-3.5205。將兩組樣品的凍干粉用去離子水復(fù)溶,配制成濃度為5、10、20、50、100 mg/mL的樣液,檢測(cè)方法同上,樣品濃度梯度為5、10、20、50、100 mg/mL,并將結(jié)果換算為Trolox當(dāng)量。以還原型谷胱甘肽(5 mg/mL)為陽性對(duì)照。

1.2.9 變性處理組海參腸多肽的DPPH自由基清除率檢測(cè) 分別取200 μL濃度為5、10、20、50、100 mg/mL的去離子水復(fù)溶后的樣液與磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L pH6.0)400 μL、DPPH(0.04 g/L)400 μL混勻后室溫避光反應(yīng)30 min,離心(2000×g,10 min),取上清液測(cè)定其在517 nm下的吸光值。以還原型谷胱甘肽(5 mg/mL)為陽性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行顯著性分析,p<0.05時(shí)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參腸主要化學(xué)組成

經(jīng)測(cè)定,海參腸原料水分含量為88.13%±0.06%,干物質(zhì)中粗蛋白、粗脂肪、總糖、還原糖及灰分含量見表1。

表1 海參腸主要化學(xué)組成Table 1 Main chemical composition of Stichopus japonicas guts

由表1可見,海參腸中粗蛋白含量高于其他主要化學(xué)成分,所占比例超過干基的70%。其次為粗脂肪與總糖,灰分含量最低。劉小芳等[23]研究表明,乳山刺參體壁和內(nèi)臟的粗蛋白含量分別為49.75%、34.90%,均低于70%,因此,本研究的海參腸是一種具有開發(fā)利用潛力的高價(jià)值蛋白資源。

2.2 海參腸酶解物的水解曲線

對(duì)海參腸進(jìn)行變性預(yù)處理,以未變性組為對(duì)照,在酶解過程中水解度隨水解時(shí)間的變化如圖1所示,在整個(gè)水解過程中,兩組海參腸在酶解前30 min內(nèi)水解度上升較快,隨后增加趨勢(shì)平緩,變性組至160 min達(dá)到平穩(wěn)期,隨后變化無顯著差異,此時(shí)其水解度達(dá)到37.28%,而未變性處理組的水解度至45 min達(dá)到23.76%,且與之后的水解度無顯著性差異。由此可知,采用中性蛋白酶水解海參腸效果良好,并且底物經(jīng)變性處理后,水解度是未變性組的1.57倍,原因可能是經(jīng)變性處理后,海參腸蛋白的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致中性蛋白酶與蛋白質(zhì)酶切位點(diǎn)間相互作用,有利于酶解過程的進(jìn)行[24],這與金文剛等[21]發(fā)現(xiàn)的蝦夷扇貝生殖腺經(jīng)熱變性處理后,其水解度增大的結(jié)果一致。

圖1 海參腸酶解液水解度曲線Fig.1 Hydrolysis degree curve of Stichopus japonicas guts hydrolysates

2.3 海參腸酶解液的可溶蛋白含量、TCA可溶性寡肽含量及肽得率

兩組海參腸酶解液中可溶蛋白含量、TCA可溶性寡肽含量及肽得率結(jié)果見表2,由表2可知,可溶性蛋白含量均低于TCA可溶性寡肽,這主要是因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)G-250法檢測(cè)到的可溶性蛋白為大分子量體系,海參腸經(jīng)過酶解后體系中的大分子量蛋白大部分被分解為小分子的可溶性寡肽,從而導(dǎo)致體系中TCA可溶性寡肽含量較多;變性處理組海參腸酶解液中可溶性蛋白含量低于未變性組,這是由于變性處理組海參腸酶解程度比未變性處理組高,蛋白質(zhì)水解為小分子肽,從而表現(xiàn)為變性處理組TCA可溶性寡肽含量和肽得率均顯著高于未變性組(p<0.05)。與未變性組相比,海參腸變性處理后TCA可溶性寡肽含量和肽得率分別提高了95%和80%,表明以中性蛋白酶酶解海參腸,變性處理所得的水解液具有較高的可溶性寡肽含量及肽得率。這與金文剛等[25]發(fā)現(xiàn)的蝦夷扇貝性腺蛋白經(jīng)100 ℃加熱處理10 min后,更易于酶解的結(jié)果一致。

表2 海參腸酶解液中可溶性蛋白、TCA可溶性寡肽含量及肽得率Table 2 Content of soluble protein,TCA-soluble oligopeptide and peptide yield of Stichopus japonicas guts hydrolysates

表3 變性處理組海參腸多肽的分子量分布結(jié)果Table 3 Results of molecular weight distribution of Stichopus japonicas guts peptides(denaturated)

2.4 海參腸多肽的分離及還原能力監(jiān)測(cè)

利用Sephadex G-25凝膠柱進(jìn)一步將海參腸變性處理和未變性處理組的酶解液進(jìn)行層析分離,并監(jiān)測(cè)其還原能力,結(jié)果見圖2。兩組海參腸酶解液經(jīng)層析分離后,主要出現(xiàn)兩個(gè)蛋白峰,都具有一定的還原能力,其中未變性處理組洗脫液在280 nm下吸光值分別在第11、20管出現(xiàn)峰值,而變性處理組洗脫液在第9、16管出現(xiàn)峰值,表明變性處理使海參腸多肽分子量的分布向較小分子量方向偏移,此外,相應(yīng)峰值的升高表明經(jīng)熱變性后,其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的回收率提高,并且樣品在700 nm下的吸光值表明其同樣具有一定的還原能力,其原因可能在于,高溫預(yù)處理使蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生松散,暴露出了更多的蛋白酶結(jié)合位點(diǎn),從而更加利于蛋白質(zhì)和蛋白酶結(jié)合[24],進(jìn)而得到了更多的小分子肽,影響其還原能力。比較變性與未變性組凝膠分離曲線可見,海參腸變性處理組酶解液組分相對(duì)比較均一,分子量比較集中,推測(cè)其與蛋白酶的充分結(jié)合作用會(huì)使海參腸蛋白分子裂解得更為徹底,使整個(gè)體系的分子量趨于均一[24]。

圖2 海參腸酶解液經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析分離及還原能力Fig.2 Reducing avtivity and separation of Stichopus japonicas guts hydrolysates by Sephadex G-25 chromatography

2.5 變性處理組海參腸多肽的分子量分布

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知變性處理組海參腸多肽的還原能力較高,因此對(duì)其分子量分布進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見圖3。以標(biāo)準(zhǔn)曲線作為參照,根據(jù)變性處理組海參腸多肽的保留時(shí)間以及峰面積,分析可知,該組海參腸多肽的分子量分布范圍主要集中于0.5～3 kDa,占水解液的57.29%,進(jìn)一步說明熱變性處理能使海參腸更加充分地與酶反應(yīng),利于酶解。金文剛等[25]對(duì)蝦夷扇貝雌性生殖腺進(jìn)行熱變性處理,酶解后分子量集中于0.25～5 kDa,與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似。

圖3 變性處理組海參腸多肽的分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of Stichopus japonicas guts peptides(denaturated)

2.6 變性處理組海參腸多肽的ABTS+自由基清除率檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果見圖4,海參腸多肽的ABTS+自由基清除率呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,在濃度低于20 mg/mL時(shí),其對(duì)ABTS+自由基的清除效果均隨濃度的提高顯著增加(p<0.05),最高達(dá)到0.51 Trolox equi/μL Sample,與袁坤山等[26]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。但是在5 mg/mL濃度下其清除率為0.25 Trolox equi/μL Sample低于GSH(0.51 Trolox equi/μL Sample)。結(jié)果表明,變性處理組海參腸多肽確實(shí)具有一定的ABTS+自由基清除能力。

圖4 變性處理組海參腸多肽的ABTS自由基清除率Fig.4 ABTS free radical scavenging rate of Stichopus japonicas guts peptides(denaturated)注:小寫字母表示兩組具有顯著差異(p<0.05);圖5同。

2.7 變性處理組海參腸多肽的DPPH自由基清除率檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果見圖5,海參腸多肽的DPPH自由基清除率在濃度低于20 mg/mL時(shí)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性,其對(duì)DPPH自由基的清除效果均隨濃度的提高顯著增加(p<0.05),最高達(dá)到90.95%。濃度為5 mg/mL時(shí)清除率為62.76%,與曹榮等[27]的研究結(jié)果接近,但是低于同濃度的GSH(90.34%)。結(jié)果表明,變性處理組海參腸多肽確實(shí)具有一定的DPPH自由基清除能力。

圖5 變性處理組海參腸多肽的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging rate of Stichopus japonicas guts peptides(denaturated)

3 結(jié)論

利用中性蛋白酶對(duì)海參腸進(jìn)行酶解,可獲得低分子量多肽,酶解效果比較好;海參腸經(jīng)變性預(yù)處理后,水解度和肽得率均有顯著提高(p<0.05),所得產(chǎn)物分子量集中于0.5～3 kDa,還原能力、ABTS+與DPPH自由基清除率檢測(cè)結(jié)果證明其具有一定的抗氧化能力。上述結(jié)果為今后對(duì)變性處理后的海參腸水解液中的活性多肽進(jìn)行分離、純化以及序列鑒定打下了基礎(chǔ)。