白及GMP基因cDNA全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)分析

許 娟，石云平，韋紹龍，蘇祖祥，林 茜，桂 杰，胡一鳳，李小泉*

(1. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2. 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.為蘭科多年生草本植物，具有上千年藥用歷史，在本草經(jīng)集注、本草圖經(jīng)及本草綱目中都有記載[1-2]。白及以塊莖(假鱗莖)入藥，塊莖組織中含40 %～50 %天然水溶性多糖。目前已從白及中分離出20多種糖苷類化合物，其中白及多糖是報(bào)道最多的化合物，也是目前最有開發(fā)前景的藥物。白及多糖具有促進(jìn)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)[3]、緩和炎癥反應(yīng)[4]等功能。近期有臨床研究報(bào)道白及膠可作為外源性重組人表皮生長(zhǎng)因子載體，能促進(jìn)創(chuàng)面表皮細(xì)胞DNA合成，加速傷口愈合等[5]。因此，研究白及多糖合成的分子機(jī)制對(duì)培育富含多糖的白及新品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】白及多糖以甘露聚糖家族的葡萄甘露聚糖為主，GDP-甘露糖的合成是白及多糖合成的第一步，GDP-甘露糖由GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase)催化甘露糖-1-磷酸而成，GMPase是甘露聚糖合成的關(guān)鍵酶[6]。1956年，Munch-Petersen[7]首次從brewer酵母中分離到一種可以催化甘露糖-1-磷酸和GTP生成GDP-甘露糖的酶，1964年其正式被命名為GDP-甘露糖焦磷酸化酶。1996年，酵母中的GMP基因首次被克隆到[8]，隨后，其它植物中的GMP基因也被克隆出來，如擬南芥[9]、馬鈴薯[10]、番木瓜[11]、水稻[12]和番茄[13]等。何春梅[14]克隆了2個(gè)鐵皮石斛GMP，分別命名為DoGMP1和DoGMP2，DoGMP1的cDNA全長(zhǎng)為1528 bp，開放性閱讀框(ORF)1086 bp，編碼362個(gè)氨基酸的蛋白；DoGMP2的cDNA全長(zhǎng)為1492 bp，開放性閱讀框(ORF)1248 bp，編碼416個(gè)氨基酸的蛋白。【本研究切入點(diǎn)】目前有關(guān)白及多糖合成的研究較少，白及GMP基因的克隆也未見報(bào)道，白及GMP基因的序列及結(jié)構(gòu)等分子生物學(xué)特性尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以白及葉片為材料，通過同源基因比對(duì)，設(shè)計(jì)兼并引物，利用RACE-PCR方法從白及中克隆GMP基因的cDNA全長(zhǎng)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為該基因在白及中的功能研究奠定基礎(chǔ)，為培育富含多糖的白及新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 采用“桂及1號(hào)”白及為試驗(yàn)品種，采取廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所種植基地生長(zhǎng)1年以上植株的新鮮葉片，用水清洗處理并擦干，迅速放入液氮中速凍，并裝袋于-80 ℃超低溫冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T載體、dCTP和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自TaKaRa公司；dNTP、TaqDNA聚合酶和氨芐青霉素(Amp)，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；SMARTerTMRACE擴(kuò)增試劑盒，購(gòu)自Clontech公司；目的條帶膠回收試劑盒，購(gòu)自QIAGEN 公司；Tris-HCl、EDTA、瓊脂糖等試劑為市銷售進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成及DNA測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 采用Primer 5和Oligo 6.0設(shè)計(jì)基因克隆所用引物。具體引物序列見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成 用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，并利用NANODROP 1000核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其濃度和純度。參照逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV說明書合成cDNA，引物為Oligo(dT)18。

1.2.2 白及GMP基因中間片段的PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI已登錄的其它植物GMP基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物GMP-F和GMP-R(表1)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25 μl：cDNA模板1 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，GMP-F，GMP-R(10 mmol/L)各0.5 μl，Taq酶0.2 μl，緩沖液2.5 μl，雙蒸水19.8 μl。擴(kuò)增程序：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃，8 min。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 引物序列

1.2.3 中間片段回收、測(cè)序 將PCR產(chǎn)物用QIAGEN PCR純化試劑盒回收，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂在含有100 μg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，在含Amp的液體LB培養(yǎng)基上37 ℃搖菌4 h，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性克隆送上海生工公司測(cè)序。

1.2.4 白及GMP基因5′與3′末端RACE擴(kuò)增 根據(jù)獲得的白及GMP基因的中間序列，分別設(shè)計(jì)5′端和3′端特異性巢式PCR引物GMP-5′1R、2R和和3′端特異性巢式PCR引物GMP-3′1F、2F(表1)，以白及葉片cDNA為模板，經(jīng)2輪巢式PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)增GMP基因的5′端和3′端序列，具體按照Clontech公司SMARTerTMRACE擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行，將目的片段進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定后，送陽(yáng)性克隆到上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 白及GMP基因cDNA全長(zhǎng)的獲得 根據(jù)中間片段、5′與3′末端的測(cè)序結(jié)果，用Vector-NTI對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和拼接，最后得到cDNA全長(zhǎng)，并設(shè)計(jì)引物GMP-F′和GMP-R′(表1)擴(kuò)增其全長(zhǎng)序列，并測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 白及GDP-甘露糖焦磷酸化酶同源基因生物信息學(xué)分析

用Premier 5和Oligo 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，用DNAmanV6軟件進(jìn)行序列拼接和序列分析。利用ORF Finder在線工具對(duì)獲得的cDNA序列進(jìn)行開放閱讀框(ORF)查找分析；用BLAST在線工具(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi/)搜索GenBank的同源序列；用BioXM 2.6對(duì)氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)；用TMpred分析該基因編碼氨基酸組成、理論分子量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；通過Softberry服務(wù)器分析白及GDP-甘露糖焦磷酸化酶蛋白的亞細(xì)胞定位；運(yùn)用NCBI的Conserved Domain Database(CDD)在線工具進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析；使用SWISS-MODEL在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1～2: 提取RNA樣品1-2: Extracted RNA samples圖1 白及“桂及1號(hào)”葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from Bletilla striata leaves

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測(cè)

以生長(zhǎng)1年以上“桂及1號(hào)”白及植株的新鮮葉片為材料，進(jìn)行葉片總RNA提取，經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，可見28S rRNA和18S rRNA條帶明亮清晰，說明所提取的RNA完整性較好。經(jīng)NANODROP 1000核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)得OD260/OD280為2.05，OD260/OD230為1.84，表明RNA純度較高，可以用于RT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

2.2 白及GMP基因全長(zhǎng)的克隆

以白及葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)約870 bp的條帶(圖2)，與預(yù)期片斷的大小一致，目的基因片段經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化及菌液PCR鑒定，得到陽(yáng)性克隆(圖3)，經(jīng)測(cè)序，目的基因大小為873 bp，經(jīng)BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該序列與鐵皮石斛、蝴蝶蘭的GMP基因同源性很高。根據(jù)獲得的白及GMP基因中間片段的序列，分別設(shè)計(jì)5′端和3′端特異性巢式PCR引物，以cDNA為模板，經(jīng)2輪巢式PCR擴(kuò)增3′端和5′端基因序列，得到3′端基因序列長(zhǎng)度為683 bp的片段和5′端基因序列長(zhǎng)度為483 bp的片段(圖4)，將其與中間片段序列進(jìn)行拼接，得到1523 bp的cDNA全長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增(圖5)，所得條帶與預(yù)期片段大小一致，測(cè)序結(jié)果表明拼接無誤。將本試驗(yàn)獲得的白及GMP基因命名為BsGMP。

M: DL2000DNA marker; 1：擴(kuò)增產(chǎn)物M: DL2000 DNA marker; 1: The fragment of RT-PCR圖2 白及GMP基因中間片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of partial GMP gene of Bletilla striata

M: DL2000 DNA marker; 1～8：陽(yáng)性克隆M: DL2000 DNA marker; 1-8: Positive clones圖3 菌液PCR結(jié)果Fig.3 PCR results of bacteria solution

M: DL2000 DNA marker; 1：3′ 端序列擴(kuò)增產(chǎn)物；2：5′ 端序列擴(kuò)增產(chǎn)物M: DL2000 DNA marker; 1: Amplification products of 3′ RACE; 2: Amplification products of 5′ RACE圖4 白及GMP基因兩端部分序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of two ends of GMP gene

2.3 BsGMP同源基因的生物信息學(xué)分析

在NCBI的ORF finder軟件上查找BsGMP的編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)該基因的ORF為1086 bp，該基因所編碼的蛋白含有361個(gè)氨基酸(圖6)，分子量為39.35 kDa，等電點(diǎn)為6.03，含量最大的3種氨基酸為：Val(11.9 %)、Leu(9.7 %)和Gly(9.1 %)；亞細(xì)胞定位分析表明，BsGMP編碼的蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，在線粒體中也有分布。Tmpred分析顯示該蛋白有2個(gè)可能的內(nèi)部到外部跨膜螺旋區(qū)和2個(gè)可能的外部到內(nèi)部跨膜螺旋區(qū)。利用NCBI的CDD在線工具進(jìn)行BsGMP蛋白功能保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明該蛋白含有醛酮還原酶的保守結(jié)構(gòu)域(第1～24個(gè)氨基酸)和LbetaH家族保守區(qū)(第256～335個(gè)氨基酸)(圖7)。

將氨基酸序列導(dǎo)入SWISS-MODEL在線分析軟件中進(jìn)行比對(duì)建模，用RasMol 2.7.5軟件對(duì)BsGMP蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯示(圖8)，可以看出，BsGMP蛋白具有11個(gè)典型的α螺旋，33個(gè)β折疊，同時(shí)具有46個(gè)β轉(zhuǎn)角。其中α螺旋用深紅色表示，β折疊用黃色表示，轉(zhuǎn)角用淡藍(lán)色表示，其他殘基用白色表示。

M: DL2000 DNA marker; 1：基因全長(zhǎng)序列M: DL2000 DNA marker; 1: Gene full-length sequence圖5 白及GMP基因cDNA全長(zhǎng)序列擴(kuò)增(1523 bp)Fig.5 Amplification results of Bletilla striata GMP gene full-length(1523 bp)

2.4 BsGMP進(jìn)化分析

將BsGMP序列與NCBI上其他物種的GMP基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)相似系數(shù)為64.0 %～95.0 %，其中與鐵皮石斛和蝴蝶蘭的相似系數(shù)最高達(dá)95.0 %。用MEGA 5.0軟件對(duì)不同物種GMP基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖9)，發(fā)現(xiàn)BsGMP與已報(bào)道的鐵皮石斛和蝴蝶蘭同源性最近，因而最先聚在一起，草莓、甜櫻桃、金絲棗、核桃、胡楊和馬鈴薯也聚為一類，紫花苜蓿和擬南芥則被單獨(dú)聚為一類，說明BsGMP基因與擬南芥親緣性最遠(yuǎn)，與蘭科植物GMP基因的親緣性較近。

3 討 論

GMP基因具有較高的保守性，GMPase催化所得產(chǎn)物 GDP-甘露糖，參與植物體內(nèi)多種代謝途徑，如蛋白質(zhì)糖基化作用、抗壞血酸、細(xì)胞壁和甘露聚糖的合成等。研究結(jié)果表明GMP與植物的逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)：李超漢等[15]發(fā)現(xiàn)番茄GMPase基因在馬鈴薯中的超表達(dá)，可使馬鈴薯抵御溫度脅迫能力明顯提高；張琳[16]對(duì)番茄中GMPase基因進(jìn)行功能分析，轉(zhuǎn)正義T1代植株，GMPase酶活性和光合性能明顯增加，果實(shí)中可溶性糖的含量和糖酸比顯著增加，有機(jī)酸的含量顯著降低；Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草GMP低水平表達(dá)時(shí)，對(duì)高溫或低溫更敏感；何春梅[14]對(duì)DoGMP1進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)DoGMP1在擬南芥中的過表達(dá)不僅可以提高擬南芥的抗壞血酸含量和多糖含量，還可以提高其種子在鹽脅迫下的萌發(fā)率和植株對(duì)鹽脅迫的耐受性。國(guó)內(nèi)外關(guān)于GMPase基因的研究還不多，只在少數(shù)作物如擬南芥[9]、馬鈴薯[10]、番木瓜[11]和水稻[12]等中克隆到了GMPase基因。Zou等[18]從番茄中克隆了GMPase基因的cDNA全長(zhǎng)，共1535 bp，包含1086 bp的ORF，編碼361個(gè)氨基酸殘基，該基因推導(dǎo)的氨基酸序列經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與馬鈴薯GMPase基因的同源性最高，達(dá)99 %，與煙草、紫花苜蓿和擬南芥的GMPase基因的同源性分別為97 %、91 %和89 %。本試驗(yàn)利用RACE方法，首次從白及中克隆到一個(gè)GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(BsGMP)，其cDNA全長(zhǎng)1523 bp，其中包含1086 bp的完整ORF，編碼361個(gè)氨基酸的多肽，理論蛋白分子量為39.05 kDa，等電點(diǎn)為6.03，呈酸性。BLAST比對(duì)結(jié)果表明BsGMP氨基酸序列與其他物種氨基酸序列相似性為64.0 %～95.0 %，氨基酸同源性數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明BsGMP基因分化后在不同物種內(nèi)仍執(zhí)行著相近的功能，與鐵皮石斛、蝴蝶蘭序列的相似性最高，達(dá)90.0 %以上，并聚為一支，說明這3個(gè)物種為一個(gè)科，同屬蘭科植物，與所對(duì)比其他物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 BsGMP序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig.6 Bletilla striata GMP gene sequence and its deduced amino acid sequence

圖7 BsGMP蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.7 Conserved domains of BsGMP

圖8 白及GMP蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.8 Three dimensional structure of GMP protein from Bletilla striata

圖9 基于GMP基因同源性的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic analysis of GMP gene from Bletilla striata

生物體中存在2種類型的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因，分為A型和B型。何春梅[15]克隆了3個(gè)鐵皮石斛GMP基因，分別命名DoGMP1、DoGMP2和DoGMP3，其中DoGMP1 和DoGMP3屬于B 型，而DoGMP2屬于A型，但3者都具有較高的同源性；對(duì)DoGMP1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白與其它植物GMP家族的成員相似，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白有2個(gè)可能的內(nèi)部到外部跨膜螺旋區(qū)和2個(gè)可能的外部到內(nèi)部跨膜螺旋區(qū)，BsGMP編碼的蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，在線粒體中也有分布。BsGMP蛋白功能保守結(jié)構(gòu)域的分析表明，該蛋白含有醛酮還原酶的保守結(jié)構(gòu)域(第1～24個(gè)氨基酸)和LbetaH家族保守區(qū)(第256～335個(gè)氨基酸)，這些保守區(qū)在細(xì)胞壁多糖合成、蛋白糖基化及蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等過程中具有重要作用[19-20]。特定蛋白有不同的螺旋數(shù)與轉(zhuǎn)角數(shù)，結(jié)構(gòu)的不同直接影響基因功能的不同，因此，下一步需要通過轉(zhuǎn)基因方法來驗(yàn)證其功能，這對(duì)于進(jìn)一步了解白及甘露糖合成關(guān)鍵酶基因GMP的功能及多糖合成分子機(jī)理具有重要意義。

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，RACE技術(shù)為基因克隆提供了方便簡(jiǎn)潔的方法。操作中尤其要對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化，以及在目的產(chǎn)物擴(kuò)增中設(shè)計(jì)好特異引物，避開發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體，防止產(chǎn)生大量非特異性或截短的產(chǎn)物。基因克隆技術(shù)的成熟完善，我們可以較易地通過克隆目的基因，并進(jìn)一步研究基因的功能結(jié)構(gòu)，今后可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高白及GMPase的活性，通過增加多糖生物合成前體GDP-甘露糖的供應(yīng)，達(dá)到大幅度提高白及塊莖多糖含量的目的，為培育富含多糖的白及新品種提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

從白及葉片中克隆到1個(gè)GMP基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為BsGMP，其長(zhǎng)度為1523 bp，包含1086 bp的完整開放閱讀框，編碼361個(gè)氨基酸。BsGMP氨基酸序列與其他物種氨基酸序列相似性為64.0 %～95.0 %。預(yù)測(cè)BsGMP編碼的多肽分子量為39.05 kDa，含量最大的3種氨基酸為：Val、Leu和Gly，等電點(diǎn)為6.03，定位于細(xì)胞質(zhì)，為不穩(wěn)定蛋白，在線粒體中也有分布，并有2個(gè)可能的內(nèi)部到外部跨膜螺旋區(qū)和2個(gè)可能的外部到內(nèi)部跨膜螺旋區(qū)。預(yù)測(cè)BsGMP蛋白有11個(gè)α螺旋，33個(gè)β折疊，46個(gè)β轉(zhuǎn)角，從第1～24個(gè)氨基酸含有醛酮還原酶的保守結(jié)構(gòu)域，第256～335個(gè)氨基酸含有LbetaH家族保守區(qū)，這些保守區(qū)是BsGMP蛋白酶活的結(jié)合區(qū)域，主要參與細(xì)胞壁多糖合成、蛋白糖基化及蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等。