大豆NIP類水孔蛋白基因的鑒定及表達特性分析

吳 偉，馮志娟，徐盛春，劉 娜，張古文，胡齊贊，龔亞明*

(1.浙江省種子管理總站，浙江 杭州 310020；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

DOI: 10.3969/j.issn.1004-1524.2018.07.01

水孔蛋白(aquaporins，AQPs)，是多基因編碼的多功能膜蛋白，通過形成運輸通道，介導胞內(nèi)或胞間物質(zhì)(水分等)選擇性跨膜轉運，調(diào)控細胞滲透壓[1-2]。AQPs蛋白具有高度保守的結構序列，由6個跨膜螺旋組成，N-端和C-端都位于細胞質(zhì)中。其中，6個跨膜螺旋由5個親水環(huán)(Loop A、B、C、D、E)相連組成，A、C和D環(huán)位于膜外，B和E環(huán)為位于膜內(nèi)，并且在B環(huán)和E環(huán)上分別有一段由3個氨基酸組成的高度保守序列NPA(天門冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸，Asn-Pro-Ala)，各自翻轉成半個跨膜螺旋，向內(nèi)膜折疊形成“水漏模型”，參與AQPs蛋白活性的調(diào)節(jié)[3]。依據(jù)氨基酸序列的同源性及亞細胞定位的不同，AQPs可以被劃分為多個亞類：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins，PIPs)，主要定位在質(zhì)膜；液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast intrinsic proteins，TIPs)，主要定位在液泡膜；類根瘤菌26膜內(nèi)在蛋白(nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)，類根瘤菌26蛋白(NOD26)是植物中第一個被發(fā)現(xiàn)的AQP蛋白，定位在大豆與根瘤菌的共生體膜上；小分子膜內(nèi)在蛋白(small basic intrinsic proteins，SIPs)，主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等[4-5]。眾多AQPs亞類的發(fā)現(xiàn)及功能鑒定表明，不同亞類的AQPs，生物學功能各不相同[6]。

NIPs亞類水孔蛋白，具有底物轉運廣泛性，不僅可以轉運水、尿素、甘油等小分子物質(zhì)，還對硼、砷、硅等非金屬元素具有滲透性，參與植物逆境脅迫應答過程[7-8]。擬南芥AtNIP5;1和AtNIP6;1[9-10]、水稻OsNIP3;1[11]、大麥HvNIP2;1具有轉運硼酸的作用[12]。水稻OsNIP2;1和OsNIP2;3[13-14]、玉米ZmNIP2;1和ZmNIP2;2具有轉運硅元素的作用[15]。過表達擬南芥AtNIP1;2能夠提高植株對鋁脅迫的耐受力[15]；AtNIP3;1和AtNIP7;1提高植株對砷脅迫的耐受力[16-17]。然而，關于大豆NIPs基因的功能仍知之甚少。

菜用大豆(vegetable soybean)，屬大豆(GlycinemaxL. Merr)的專用型品種，主食嫩莢和籽粒，富含氨基酸、維生素、纖維素等，具有極高營養(yǎng)價值，是一種新興的特種蔬菜。近年頻發(fā)的自然干旱，嚴重制約了菜用大豆產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的提升。本研究擬利用已知的擬南芥NIPs序列，開展對大豆NIPs染色體定位、蛋白結構、進化關系、基因結構、組織表達模式及干旱應答的研究，為進一步研究該亞類基因成員的功能及抗旱分子改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 大豆NIPs的鑒定

首先，利用水孔蛋白保守結構域的隱馬氏模型(Pfam號碼：PF00230)和NIP亞類水孔蛋白的通路模型(KEGG號碼：K09874)[18]；接著，利用HMMER3.0軟件，分別搜索大豆基因組數(shù)據(jù)庫Phytozomev11.0，獲得候選大豆NIPs。進一步，利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/batch.pl)和 CDD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對檢索到的候選NIPs蛋白序列進行逐一確定；同時，參考已知的擬南芥、玉米和水稻NIPs蛋白序列信息[19-21]，手工去除冗余序列和不含有NIP特征結構域的序列，獲得大豆NIPs的蛋白序列。最后，利用Phyre v2.0軟件對大豆NIPs蛋白的3D結構進行預測[22]。

1.2 大豆NIPs系統(tǒng)進化樹的構建

根據(jù)已獲取的大豆NIPs蛋白序列，利用 ClustalW2 進行蛋白多序列比對。利用MEGA6.0軟件的鄰接法NJ(neighbor-joining)構建NIP的系統(tǒng)進化樹[23]。進化樹分支上的數(shù)值表示重復1 000次出現(xiàn)的次數(shù)。

1.3 大豆NIPs基因結構的分析

從大豆基因組數(shù)據(jù)庫Phytozomev11.0分別獲取NIPs的DNA序列和CDS序列，利用GSDS在線工具對所有大豆NIP進行內(nèi)含子-外顯子組成分析[24]。

1.4 大豆NIPs基因結構的分析

從大豆基因組數(shù)據(jù)庫中選取NIPs基因起始密碼子上游1 500 bp的DNA序列作為啟動子區(qū)段，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線工具進行順式作用元件分析。

1.5 大豆NIPs基因的不同組織表達分析

利用大豆NIPs基因的ID，直接從大豆基因組數(shù)據(jù)庫Phytozomev11.0獲取NIPs基因在9種不同組織(根、莖、葉、花、種子、豆莢、發(fā)根、根瘤、頂端分生組織)的GeneAtlas Tissue Sample表達數(shù)據(jù)即芯片表達數(shù)據(jù)[25]。進一步，利用TreeView程序分析不同NIPs基因的表達特征[26]。

1.6 菜用大豆干旱脅迫處理

以菜用大豆種子(種質(zhì)編號GMLN012012017)為實驗材料，每盆播種4粒，置于22 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (16 h/8 h，光/暗)。將長勢相近的3周大幼苗根部用20% PEG 6000浸泡處理，處理時間為0.5、1.5、6.0、12.0 h，選取相同時間段未處理的樣品作為對照組，分別取整株幼苗置于液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.7 實時定量RT-PCR分析

利用天根的RNAsimple總RNA提取試劑盒進行菜用大豆植株RNA提取。利用天根的FastQuantcDNA第一鏈合成反轉錄試劑盒進行cDNA合成，均一化后作為實時定量PCR模板。利用KAPA SYBR?FastqPCR試劑盒進行熒光定量PCR，以GmActin11作為內(nèi)參基因[27]。其中，GmNIP1;5正向引物序列F： ATAACAGAGCGGTTGGTGAG，反向引物序列R: GGCTTCTAGCTGGGTTCATT。PCR總反應體系為20 μL，經(jīng)預實驗優(yōu)化后PCR反應程序為：第一步，1個循環(huán)，95 ℃預變性10 min；第二步，40個循環(huán)，95 ℃ 7 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 30 s；繪制熔解曲線，0.2 ℃·s-1。試驗設置3次生物學重復。采用相對定量2-ΔΔCt方法計算NIP基因在干旱處理下某個時間點相對于對照的轉錄水平變化[28]。

2 結果與分析

2.1 大豆NIPs的全基因組鑒定

在大豆基因組中搜索到13個NIPs基因(表1)：分布在10條大豆染色體上，其中，第2和8號染色體上都有2個NIPs基因，其他染色體上各含有1個NIPs基因。蛋白質(zhì)生化屬性分析發(fā)現(xiàn)：最長的序列有296個氨基酸殘基(NIP7;1)，最短的序列有261個氨基酸殘基(NIP4;1和NIP4;2)；其中等電點范圍從6.41(NIP1;5)到9.61(NIP1;1)，分子量范圍從27.59 ku(NIP4;2)到31.42 ku(NIP7;1)。保守結構域比對分析顯示，所有NIP均含有典型的6個跨膜結構(TM1-TM6)和2個NPA結構域(圖1)。同樣，3D結構分析顯示，所有NIP均含有由5個環(huán)連接形成的6個保守跨膜螺旋結構(圖2)。

2.2 大豆NIPs的生物進化

為了解大豆NIPs的進化關系，利用大豆GmNIPs與已知的擬南芥AtNIPs、玉米ZmNIPs和水稻OsNIPs蛋白全長序列構建了系統(tǒng)進化樹(圖3)。結果顯示：不同物種NIPs基因進化分支并不完全一致，每個進化分支并不是同時含有這4個物種的NIPs基因成員。其中，大部分GmNIPs與擬南芥AtNIPs的進化關系更為接近(GmNIP5;1和GmNIP6;1 除外)。說明大豆和擬南芥、水稻、玉米的物種分化可能早于NIPs基因的分化。

表1 大豆NIPs的鑒定及特性

TM1-6代表跨膜結構域。TM1-6 represented trans-membrane domains.圖1 大豆NIPs蛋白的保守結構域Fig.1 Conserved domains of soybean NIPs

圖2 大豆NIPs蛋白的3D結構Fig.2 3D structure of soybean NIP proteins

2.3 大豆NIPs基因結構

內(nèi)含子-外顯子結構在基因家族進化中起重要作用。13個大豆GmNIPs基因啟動子分析顯示(圖4)：所有GmNIPs均含有5個外顯子和4個內(nèi)含子；然而，不同NIPs基因成員的上游和下游序列長度各不相同，緊挨上游和下游的兩個外顯子的長度各不相同，內(nèi)含子長度各不相同，暗示不同的GmNIPs基因表達調(diào)控模式可能存在差異。

2.4 大豆NIPs基因啟動子元件

基因上游啟動子中所含作用元件可以反映其是否參與相應逆境和激素應答過程。13個大豆GmNIPs基因啟動子分析顯示(表2)：77%的成員在啟動子區(qū)域含有HSE(heat stress responsive element)作用元件(與高溫有關)；69%含有MBS作用元件(與干旱有關)；69%的成員含有TC-rich repeat元件(與逆境脅迫有關)；23%的成員含有LTRE(low temperature responsive element)作用元件(與低溫有關)，這4類元件都與逆境脅迫應答有關。此外，大豆GmNIPs基因啟動子中69%含有TGA(auxin-responsive element)作用元件；62%的成員含有CGTCA(MeJA-responsive element)作用元件；54% 的成員含有ERE(ethylene-responsive element)作用元件；54%含有GARE(gibberellin-responsive element)作用元件；46%的成員在啟動子區(qū)含有ABRE(ABA-responsive element)作用元件；38%的成員含有TCA(salicylic acid-responsive element)作用元件，這6類元件都與激素應答有關。暗示大豆GmNIPs基因參與植物的逆境及激素脅迫應答過程。其中，GmNIP7;2和GmNIP4;1含有3～5個HSE元件；GmNIP4;2含有3個MBS元件；GmNIP1;5含有3個TC-rich repeat元件；GmNIP2;1分別含有3個TC-rich repeat和4個ABRE、CGTCA和TCA元件；GmNIP6;1分別含有3個CGTCA、GARE和TCA元件，說明這6個基因極有可能直接參與逆境脅迫或ABA、GA、MeJA、SA、Auxin信號應答過程。

圓形代表大豆NIPs，三角形代表擬南芥NIPs，正方形代表玉米NIPs，菱形代表水稻NIPs。The circular icons represented soybean NIPs， triangle icons represented Arabidopsis NIPs， square icons represented maize NIPs， diamond icons represented rice NIPs.圖3 大豆和擬南芥NIPs的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the soybean， Arabidopsis， maize and rice NIP members

2.5 NIPs基因在大豆不同組織中的表達模式

從大豆數(shù)據(jù)庫中收集到13個NIPs基因表達數(shù)據(jù)，結果顯示：不同的NIPs基因成員，組織表達模式各不相同，僅部分基因表達量相對較高(圖5)。其中，GmTIP1;5在根瘤和根毛中表達較高，GmNIP1;1在根中表達量較高，在其他組織表達量較低，提示其可能和根瘤或根的發(fā)育過程有關；GmNIP1;3、GmNIP5;1和GmNIP6;1在各個組織中廣泛表達。組織表達模式的差異暗示GmNIPs基因功能發(fā)生了分化。

圖5 大豆NIPs基因組織表達特性Fig.5 Expression analysis of soybean NIPs in different tissues

2.6 菜用大豆GMNIP1;5基因干旱表達譜

進一步以表達量最高的GmNIP1;5為候選基因，利用熒光定量PCR對其在干旱脅迫下的基因表達量進行了分析(圖6)，結果顯示：GmNIP1;5基因在干旱脅迫處理1.5和6.0 h表達量上調(diào)，說明GmNIP1;5基因參與干旱應答過程。

**表示差異極顯著。** represents the significance at P<0.01.圖6 大豆GmNIP1;5基因干旱表達譜Fig.6 Expression analysis of soybean GmNIP1;5 in response to drought stress

3 討論

AQPs廣泛存在于植物中，在物質(zhì)(水分等)跨膜運輸途徑中發(fā)揮重要生理功能，是功能基因組學研究的熱點內(nèi)容，在農(nóng)業(yè)上具有廣闊的應用前景[5]。AQPs以基因家族形式存在，根據(jù)其序列相似性規(guī)律來進行分類[3]。2001年，根據(jù)擬南芥基因組信息分析，AQPs各亞類命名體系基本形成[3]。近年來，隨著大量基因組數(shù)據(jù)信息的出現(xiàn)，大量新AQPs被發(fā)現(xiàn)[21-26]。本文參照擬南芥NIPs亞類基因，通過大豆全基因組分析，共鑒定到13個大豆NIPs基因(表1)，所編碼蛋白均含有保守的跨膜螺旋區(qū)和NPA結構域(圖1)，進一步進化關系分析發(fā)現(xiàn)，部分大豆NIPs與雙子葉模式植物擬南芥NIPs聚集為一類，其余大豆NIPs與單子葉模式植物水稻和玉米的NIPs基因聚集為一類(圖3)，推測同一進化分支的NIPs基因可能具有更相似的生物學功能。如，大豆GmNIP1;1、GmNIP1;2、GmNIP1;3、GmNIP1;4、GmNIP1;5與擬南芥AtNIP1;2處于同一進化分支，可能參與鋁脅迫應答過程；大豆GmNIP3;1與擬南芥AtNIP5;1和AtNIP6;1及水稻OsNIP3;1處于同一進化分支，可能參與硼酸轉運過程；大豆GmNIP5;1和GmNIP6;1與玉米ZmNIP2;1和ZmNIP2;2以及水稻OsNIP2;1處于同一進化分支，可能參與硅轉運過程；大豆GmNIP7;1和GmNIP7;2與擬南芥AtNIP7;1處于同一進化分支，可能參與砷脅迫應答過程。

AQPs基因的表達具有時空特異性。在有水分大量流動的植物組織和器官中表達量很高：如根表皮、外皮層和內(nèi)皮層細胞、靠近木質(zhì)部導管的木薄壁細胞、韌皮部伴胞、保衛(wèi)細胞；在植物發(fā)育的特定階段表達：如種子萌發(fā)、細胞伸長、花粉管伸長、維管形成時期[27]。擬南芥α-TIP在種子貯藏囊泡中特異表達，煙草TobRB7在根柱中表達，而煙草NtAQP在根中靠近維管組織細胞表達，向日葵SunTIP27和SunTIP220均在保衛(wèi)細胞中表達，冰草的MIP2A在根的分生組織及木薄壁細胞中表達。本文利用生物芯片數(shù)據(jù)綜合分析了大豆所有NIPs亞類基因的組織表達特異性，結果發(fā)現(xiàn)GmNIP1;3、GmNIP5;1、GmNIP6;1在多個組織表達；GmNIP1;1僅在根中表達；GmNIP1;5在根瘤和發(fā)根中特異表達；其余NIPs基因表達量均較低(圖5)。不同NIPs基因在植物發(fā)育的不同階段編碼表達，可能與其所參與的不同生理過程相關。

AQPs基因的表達受多種逆境脅迫信號的影響。在擬南芥、水稻、玉米、白菜、油菜、馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)，AQPs基因受干旱、高鹽、低溫不同程度的誘導表達[31-35]。在低溫脅迫下，超表達擬南芥AtPIP1;4和AtPIP2;5基因，增強水的吸收轉運和向上運輸能力，從而賦予轉基因株系對低溫的耐受力[36]。在干旱脅迫下，過表達SlTIP2;1基因的番茄植株，與對照植株相比都具有較高的存活率和果實產(chǎn)量[37]。過表達小麥TaNIP可提高植株體內(nèi)K+、Ca2+及脯氨酸的積累，降低NaCl含量的積累，增強植株耐鹽性[38]。在硼虧缺情況下，敲除水稻OsNIP3;1基因后，會改變水稻芽尖硼的運輸分配，導致水稻生長發(fā)育嚴重受損[39]。本文通過啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)NIPs亞類基因含有脅迫(高溫、干旱、低溫)和激素(脫落酸、赤霉素、乙烯、茉莉酸、水楊酸、生長激素)應答元件；然而，不同NIPs基因成員所含元件種類和數(shù)量各不相同(表2)，說明不同NIPs基因的表達調(diào)控方式可能存在特異性。進一步利用熒光定量分析了GmNIP1;5基因對干旱脅迫的響應情況，發(fā)現(xiàn)其響應干旱脅迫(圖6)，其具體耐逆分子機理仍需進一步的實驗證實。