VKORC1基因多態(tài)性與川崎病并發(fā)冠狀動脈瘤患兒華法林穩(wěn)定劑量相關(guān)性研究

謝小斐 張 麗 黃 萍 于明華 汪周平 王燕飛 李 偉

川崎病(KD)形成的冠狀動脈瘤(CAA)，尤其是巨大冠狀動脈瘤(GCAA)，易并發(fā)血栓、狹窄和閉塞，可導(dǎo)致心肌缺血、梗死和缺血性心臟病，已經(jīng)成為兒童時期最常見的獲得性心臟病。美國心臟病協(xié)會及部分專家建議KD合并大CAA或GCAA的患者長期行抗血栓治療[1,2,3]，推薦華法林聯(lián)用小劑量阿司匹林和(或)氯吡格雷。然而,華法林治療窗窄、影響因素多，復(fù)習(xí)成人的相關(guān)研究和國內(nèi)不多的兒童相關(guān)研究顯示[4]，華法林劑量達(dá)穩(wěn)態(tài)具有基因?qū)W背景，有人種差別，兒童和成人也有差別，不同個體服用藥物劑量相差20倍以上[4]，限制了華法林在兒童中的廣泛應(yīng)用。目前尚缺乏中國兒童KD并發(fā)CAA華法林劑量達(dá)穩(wěn)態(tài)計算公式。本文結(jié)合廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(我院)KD CAA或GCAA患兒臨床資料，探討VKORC1 基因多態(tài)性、臨床因素與華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)性，通過多元回歸分析評價中國KD兒童華法林穩(wěn)定劑量的主要影響因素，為臨床合理個體化華法林治療提供依據(jù)。

1 方法

1.1 KD和KD GCAA診斷標(biāo)準(zhǔn) KD診斷符合 2005 年修訂版 KD 診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。KD GCAA的診斷符合1984年冠狀動脈病變(CAL)標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動脈內(nèi)徑≥8 mm[7]。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①在我院診斷KD GCAA或冠狀動脈短期內(nèi)急劇擴張并有血栓樣回聲者；②藥物依從性佳且可以堅持長期隨診；③口服穩(wěn)定劑量華法林≥2個月，同時期目標(biāo)國際化比值比(INR)穩(wěn)定在2.0～2.5≥2個月；④肝功能、腎功能、電解質(zhì)、血常規(guī)、尿常規(guī)指標(biāo)均在正常值范圍。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 可能存在其他CAA的疾病，如多發(fā)性血管炎等。

1.4 分組考慮CYP2C9和VKORC1是公認(rèn)影響華法林穩(wěn)定劑量主要的2個基因，美國FDA在2010年建議服用華法林藥物的患者檢測CYP2C9*3和VKORC1 1639G>A(rs9923231)基因型用以指導(dǎo)用藥[8]，本文選擇了CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、VKORC1(rs9923231)基因位點的多態(tài)性進(jìn)行檢測并分組分析，CYP2C9再分為AA型、AC型和CC型，VKORC1 rs9923231 再分為TT型、TC型和CC型。在華法林用藥前和后行上述基因檢測，分為華法林治療前基因檢測和治療后基因檢測組。

1.5 應(yīng)用華法林病例藥物基因多態(tài)性的檢測 采集患兒外周靜脈血3 mL(已二胺四乙酸抗凝)，使用BloodGen Midi Kit (康為世紀(jì)生物科技有限公司) 提取患兒全基因組DNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)CYP2C9*2、CYP2C9*3、VOKRC1序列設(shè)計引物，見表1，以*1野生型作為參考序列，采用PCR法進(jìn)行擴增。各基因外顯子的PCR擴增產(chǎn)物用美國ABI公司3730XL 測序儀測序，測序引物采用原PCR引物并進(jìn)行測通?；驍U增及序列分析均由北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心有限公司完成。

表1 華法林項目基因分析引物序列

1.6 GCAA治療原則和知情同意 根據(jù)2004年美國心臟協(xié)會(AHA)提出的KD診治指南[3]及2012年KD CAA的臨床處理建議[9]：KD患兒并發(fā)GCAA或冠狀動脈急劇擴張并血栓樣回聲時，建議華法林抗凝治療[INR 2.0～2.5]。應(yīng)用華法林時根據(jù)特殊病情需要酌情考慮聯(lián)合其他用藥。GCAA應(yīng)用華法林治療經(jīng)由患兒家長簽署知情同意書。

華法林劑量選擇符合適用的藥片規(guī)格(山東濟(jì)南齊魯制藥有限公司產(chǎn)品為2.5 mg，芬蘭 Orion公司產(chǎn)品為3.0 mg)，便于分配。①門診不用負(fù)荷劑量，華法林起始劑量基于年齡、體重計算：<2歲0.1 mg·kg-1，～12歲0.09 mg·kg-1，>12歲0.08 mg·kg-1；之后根據(jù)INR調(diào)整華法林劑量[10]。②因GCAA并發(fā)血栓住院的KD患兒需快速抗凝[10]，華法林使用起始階段聯(lián)合使用低分子肝素5 d以上，起始量第1 d(若INR基礎(chǔ)值為1.0～1.3)，華法林負(fù)荷劑量為0.2 mg·kg-1(最大劑量為10 mg)；第2～4 d INR為1.1～1.3、1.4～1.9、2.0～3.0、3.1～3.5、>3.5時，調(diào)整方法分別為重復(fù)負(fù)荷劑量、50%負(fù)荷劑量、50%負(fù)荷劑量、25%負(fù)荷劑量、停藥直至INR<3.5(然后以上次劑量的50%重新開始)。維持量(INR達(dá)到目標(biāo)值3～4 d后)，INR為1.1～1.3、1.4～1.9、2.0～3.0、3.1～3.5、>3.5時，調(diào)整方法分別為劑量增加20%、劑量增加10%、劑量不變、劑量減小20%、停藥直至INR<3.5(然后以原始劑量的50%重新開始)。如果INR達(dá)到目標(biāo)范圍并持續(xù)2 d以上，可停用低分子肝素治療。此后根據(jù)INR結(jié)果的穩(wěn)定性數(shù)天至1周監(jiān)測1次INR，根據(jù)情況可延長，穩(wěn)定后可每4～6周監(jiān)測1次。③遵守飲食禁忌，避免富含維生素K的食物和影響維生素K代謝的藥物，保持食物結(jié)構(gòu)的相對平衡，不隨意更改攝入蔬菜的種類和數(shù)量。

華法林達(dá)穩(wěn)態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)：至少連續(xù)2個月服用同一華法林劑量，連續(xù)至少3次檢測INR波動在2.0～2.5，且每2次間隔時間≥28 d。

1.7 資料截取 ①性別，②起始應(yīng)用華法林和調(diào)整華法林劑量時的年齡、體重、身高、體表面積，③華法林使用后，INR不穩(wěn)定時，是否存在發(fā)熱、合用退熱藥或抗生素等影響維生素K代謝的藥物，④應(yīng)用華法林后的飲食習(xí)慣，⑤應(yīng)用華法林后的不良反應(yīng)：出血(皮下出血、牙齦出血、血便、血尿、頭顱出血)，胃腸道不適(惡心、嘔吐、腹瀉)，皮疹、脫發(fā)、肝酶升高等。

需要說明的是，華法林用藥前及用藥期間反復(fù)對患兒家長進(jìn)行飲食及注意事項的培訓(xùn)，并對INR不穩(wěn)定患兒進(jìn)行飲食監(jiān)控。我院參照文獻(xiàn)[3]和[9]，要求KD GCAA或冠狀動脈短期內(nèi)急劇擴張并血栓樣回聲患兒于急性期出院后1、2、6和12個月返院復(fù)查心電圖和超聲心動圖，以后根據(jù)情況每6個月返院復(fù)查。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 我院2011年9月1日至2017年4月1日符合本文納入、排除標(biāo)準(zhǔn)的患兒42例[GCAA 41例，1例短期內(nèi)迅速擴張的冠狀動脈多發(fā)瘤(RCA 7.5 mm)也有使用華法林指征，故納入]；男35例(83.3%)，女7例；≤1歲 7例，～2歲7例，～3歲7例；～4歲6例；～5歲7例；～6歲5例；～7歲3例。平均年齡(3.2±1.8)歲，平均身高(92.5±15.4) cm，平均體重(13.7±4.0)kg，平均體表面積(0.59±0.14)m2，華法林達(dá)穩(wěn)態(tài)時間為4.0 (3.0,8.8)個月，最長達(dá)穩(wěn)態(tài)時間為25個月。42例患兒在急性期均伴不同程度的附壁血栓，經(jīng)過治療后心臟彩超未見明顯血栓。41例患兒在隨訪過程中心電圖均正常，1例在入院前已出現(xiàn)缺血性心肌病心電圖表現(xiàn)。2例葡萄糖6磷酸酶缺乏癥KD GCAA患兒予華法林聯(lián)用氯吡格雷抗栓治療，40例患兒予華法林聯(lián)用阿司匹林抗栓治療。1例院前因右冠狀動脈栓塞致缺血性心肌病的KD GCAA患兒長期服用酒石酸美托洛爾片和卡托普利片。

2.2CYP2C9*3和VKORC1不同基因型之間比較 表2顯示，CYP2C9基因型野生型(CYP2C9*1*1)39例(92.9%)，未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*2位點變異，CYP2C9*3雜合變異3例。其中1例CYP2C9*3雜合變異合并VKORC1 CT型干擾統(tǒng)計分析，去除此例后，CYP2C9野生型及CYP2C9*3雜合變異型經(jīng)體重矯正后華法林穩(wěn)定劑量分別為0.107±0.026、0.067±0.067(t=1.9，P=0.035)，后者比前者低27.1%。VKORC1 rs9923231 TT型36例(85.7%)，CT型6例(14.3%)，經(jīng)體重矯正前兩種基因型的華法林達(dá)穩(wěn)態(tài)劑量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)體重矯正后CT型華法林達(dá)穩(wěn)態(tài)劑量明顯高于TT型。各基因位點檢測結(jié)果均符合Hardy-weiberg遺傳平衡定律(P>0.05)，研究人群符合群體基因遺傳平衡。

表2 KD CAA達(dá)華法林穩(wěn)態(tài)患兒CYP2C9*3和VKORC1不同基因型一般情況及華法林劑量的比較

注 劑量1：經(jīng)體重矯正后每日華法林劑量；劑量2：未經(jīng)體重矯正每日華法林劑量

2.3 華法林服藥前和后行基因檢測與達(dá)穩(wěn)態(tài)時間比較 表3顯示，用藥前測基因型達(dá)穩(wěn)態(tài)時間較用藥后測基因型縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。VKORC1 CT型按常規(guī)劑量INR不易達(dá)標(biāo)，在基因檢測指導(dǎo)下用藥達(dá)穩(wěn)態(tài)時間縮短。出血并發(fā)癥在兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。VKORC1 TT型和CYP2C9 AC型患兒INR易反復(fù)高于目標(biāo)范圍，部分出現(xiàn)出血并發(fā)癥。

表3 服用華法林前后測基因組達(dá)穩(wěn)態(tài)時間、出血并發(fā)癥及各基因型INR情況比較

2.4 影響華法林達(dá)穩(wěn)態(tài)的單因素分析 表4顯示，未經(jīng)體重矯正的華法林穩(wěn)態(tài)劑量與年齡、體重、身高、體表面積相關(guān)。經(jīng)體重矯正后華法林穩(wěn)定劑量僅與VKORC1基因多態(tài)性相關(guān)義。

表4 KD GCAA患兒影響華法林達(dá)穩(wěn)態(tài)的單因素分析

注r1：各因素與未經(jīng)體重矯正的華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)系數(shù)；r2：各因素與經(jīng)體重矯正后華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)系數(shù)

2.5 影響華法林達(dá)穩(wěn)態(tài)的多因素分析 將因變量設(shè)定為經(jīng)體重矯正后華法林穩(wěn)態(tài)劑量，將性別、年齡、體重、身高、體表面積、VKORC1基因多態(tài)性作為自變量行多元逐步回歸分析，表5顯示，VKORC1基因多態(tài)性是經(jīng)體重矯正后華法林穩(wěn)定劑量的唯一影響因素，可以解釋43.8%經(jīng)體重矯正華法林穩(wěn)定劑量的個體差異。將因變量改為華法林未經(jīng)體重矯正穩(wěn)定劑量進(jìn)行分析，表6顯示，根據(jù)最佳回歸模型得到多元回歸方程：華法林穩(wěn)定劑量(mg·d-1)=-0.407+0.088×體重+0.580×VKORC1 rs9923231基因型(1if TT, 2 if CT)，R2為0.632,可以解釋穩(wěn)定劑量63.2%的個體差異，其中體重和VKORC1基因多態(tài)性的貢獻(xiàn)分別為43.7%和19.5%。

3 討論

表5 VKORC1和各臨床因素在預(yù)測經(jīng)體重矯正華法林穩(wěn)態(tài)劑量多元回歸模型中的貢獻(xiàn)

注 1)經(jīng)體重矯正華法林穩(wěn)態(tài)劑量(mg·kg-1·d-1)=0.039+0.061×VKORC1 rs9923231基因型(1 if TT,2 if CT)

表6 VKORC1和各臨床因素在預(yù)測未經(jīng)體重矯正華法林穩(wěn)態(tài)劑量多元回歸模型中的貢獻(xiàn)

注 1)未經(jīng)體重矯正華法林穩(wěn)態(tài)劑量(mg·d-1)=-0.407+0.088×體重+0.580×VKORC1rs9923231基因型(1if TT, 2 if CT)

研究顯示KD中冠狀動脈內(nèi)徑>6 mm的CAA超過一半15年后發(fā)展為狹窄，KD患兒中幾乎所有缺血性心肌病的發(fā)生及死亡均與CAA，尤其GCAA密切相關(guān)[11]，這類患兒需終身抗凝預(yù)防血栓栓塞事件發(fā)生。在應(yīng)用華法林抗凝治療過程中，由于華法林安全范圍窄、影響因素多、個體差異大，尤其是嬰幼兒，食物成分和類型不固定，體重小需要分藥，過度抗凝容易出血，抗凝不夠又易形成血栓，給臨床工作造成困擾。近年來國內(nèi)外成人華法林的研究顯示VKORC1及CYP2C9基因多態(tài)性是影響華法林穩(wěn)定劑量最主要的遺傳因素，兩者在不同的人群中對華法林穩(wěn)定劑量個體差異的貢獻(xiàn)分別為15%～46.9%、5%～22%[12-19]。兒童處于生長發(fā)育階段，生理特點與成人不同，為數(shù)不多的兒童華法林研究中VKORC1及CYP2C9對穩(wěn)定劑量的貢獻(xiàn)分別為3.7%～47%(n=37)、2%～12.8%(n=120)[20-22，27]，意見并不統(tǒng)一，而且樣本量也不大，年齡跨度大(從嬰幼兒到青春期)。

在CYP2C9與華法林劑量相關(guān)性的研究中，CYP2C9*2和CYP2C9*3是研究比較多的2個位點，CYP2C9*2和*3突變，導(dǎo)致酶活性降低，從而使華法林代謝減慢，日均穩(wěn)定劑量比野生型CYP2C9*1型降低。本研究中未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*2基因的變異，CYP2C9*3僅有3例雜合，因此CYP2C9*2和CYP2C9*3未進(jìn)一步參與多元回歸分析。CYP2C9*3雜合變異型比野生型劑量降低約27%，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報道一致[23]。本研究中1例CYP2C9*3雜合變異治療初期予常規(guī)治療劑量后INR升至6.39，未見出血表現(xiàn)，與文獻(xiàn)報道一致[24],對此類患兒要降低華法林初始劑量，藥物調(diào)整速度要比野生型慢，需特別注意避免過度抗凝及出血并發(fā)癥。

本研究中VKORC1 rs9923231僅有TT型(85.7%)及CT型(14.3%)，未見CC型，與中國成人漢族研究的基因型分布基本一致[19]。華法林穩(wěn)定劑量在未經(jīng)體重矯正前與VKORC1的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)體重矯正后與VKORC1相關(guān)性差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明體重干擾了VKORC1基因多態(tài)性對華法林穩(wěn)定劑量影響的判斷。TT型及CT型經(jīng)體重矯正后華法林穩(wěn)定劑量分別為(0.10±0.021)和(0.16±0.043)mg·kg-1·d-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。未經(jīng)體重矯正華法林穩(wěn)定劑量設(shè)定為因變量時得出的最佳模型可以解釋63.2%的用量個體差異，體重和VKORC1對用量個體差異的貢獻(xiàn)分別為43.7%和19.5%。當(dāng)把因變量設(shè)定為經(jīng)體重矯正華法林穩(wěn)定劑量時，VKORC1是唯一進(jìn)入模型的自變量，可以解釋43.8%的個體差異，進(jìn)一步說明經(jīng)體重矯正華法林用量的公式中，會損失體重的影響，導(dǎo)致模型的R2值下降。本研究結(jié)果與英國Kaitlyn等對兒童華法林的研究結(jié)果基本一致，后者體重和VKORC1對華法林用量的個體差異貢獻(xiàn)分別為52.8%和12.2%,加上CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3及Fontan手術(shù)指征，回歸模型的總體貢獻(xiàn)達(dá)76.3%[25]；本研究因CYP2C9未參與分析，對個體差異的影響有一定的損失。本研究VKORC1基因多態(tài)性對華法林穩(wěn)定劑量個體差異的影響為19.5%，位于成人報道的15%～46.9%[12-15,18,19]和兒童報道的18%～47%[20-22]的低值，考慮與本文患兒平均年齡小，參與藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的酶類并未完全成熟有關(guān)[26,27]。本研究6例VKORC1 CT型患兒中有5例在治療早期按常規(guī)劑量反復(fù)調(diào)整藥量INR難以達(dá)標(biāo)，其中4例在基因檢測結(jié)果出來后將劑量增加至0.136～0.22 mg·kg-1·d-1后INR才達(dá)標(biāo)，與文獻(xiàn)報道一致[24]。本研究36例VKORC1 TT型患兒在治療初期常規(guī)劑量下有1例出現(xiàn)血尿(INR 3.0)，1例出現(xiàn)嚴(yán)重的鼻衄(INR 8.3)，15例治療初期INR易升高，其他患兒未出現(xiàn)明顯出血并發(fā)癥及INR反復(fù)升高超過3.0，與文獻(xiàn)報道一致[24]。因此，對于VKORC1變異型初始劑量也需要減少，藥物調(diào)整速度要比野生型慢，也需要避免過度抗凝及出血并發(fā)癥。

G?ttl等[28]認(rèn)為，由于體重、身高是隨年齡增長的，并未將這兩項放入經(jīng)體重矯正華法林穩(wěn)定劑量模型，結(jié)果顯示，年齡對個體差異貢獻(xiàn)約28.3%，Kato等[29]的研究中年齡也是主要影響因素，每增加1歲，華法林的抗凝效果下降10.5%；而Moreau等[20]和Biss等[22]研究中未經(jīng)體重矯正華法林穩(wěn)定劑量主要跟身高密切相關(guān)。本研究中體重成為華法林穩(wěn)定劑量模型中對個體差異影響最大的因素，與以上結(jié)果不同，可能與以下因素有關(guān)：①由于很多生理過程(如基礎(chǔ)代謝、腎小球濾過率)與體表面積的關(guān)系比體重、年齡更為密切，因此按體表面積更為合理[24]。本研究的體表面積是按體重法計算，有可能低估了身高在其中的作用。②Moreau等[20]和Biss等[22]研究中患兒的平均年齡分別為9歲和11歲，已接近或進(jìn)入青春期，與藥代學(xué)及藥動學(xué)相關(guān)的酶類相對成熟，身高進(jìn)入第二生長高峰期，身高的增長相比年齡和體重更突出。Murry等[31]和Takahashi等[32]的研究結(jié)果提示，身高與肝臟大小呈正相關(guān)，肝臟增大導(dǎo)致經(jīng)肝臟代謝清除的華法林更多，達(dá)到相同藥效需要服用更大劑量的華法林。③無論是體重還是身高，均伴隨年齡增長。前者代表的是患者身體的成長程度，后者是代表負(fù)責(zé)參與藥代動力學(xué)的器官是否成熟，兩者并不能完全替代，對于新生兒和嬰幼兒來說，負(fù)責(zé)藥物清除器官的成熟是藥代動力學(xué)的重要決定因素[26]，因此迫切需要建立兒童華法林的藥代動力學(xué)/藥效學(xué)模型，提高藥物基因模型預(yù)測的準(zhǔn)確性。

本研究結(jié)果提示，VKORC1基因多態(tài)性是影響華法林穩(wěn)定劑量的遺傳因素之一，對于6月齡至7歲兒童，體重是影響華法林穩(wěn)態(tài)劑量最重要的影響因素，對于治療初始階段常規(guī)劑量INR易超標(biāo)伴出血或不能達(dá)到目標(biāo)INR的患兒，藥物基因篩查有一定指導(dǎo)意義，可快速、有效達(dá)目標(biāo)INR，減少出血的并發(fā)癥。

本研究的局限性：①樣本量太少，但每個年齡段分布人數(shù)比較均勻，華法林穩(wěn)態(tài)時間控制比較嚴(yán)格，最長的達(dá)2年余(同一劑量)，數(shù)據(jù)仍有一定的代表性，預(yù)測公式有助于解釋影響川崎病兒童華法林穩(wěn)定劑量個體差異的原因，后續(xù)有待進(jìn)一步擴大樣本量進(jìn)行更全面的研究；②部分資料是回顧性分析時獲取，在以后的隨訪研究中可以對患兒的飲食成分及合用藥物進(jìn)行分類設(shè)計和管理。