青稞類鈣調(diào)素蛋白基因 CML19的克隆、序列分析及原核表達(dá)

韋澤秀，原紅軍,扎 桑，王玉林，徐齊君，曾興權(quán)，尼瑪扎西,4

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，拉薩 850002；2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，拉薩 850002；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)業(yè)研究所，拉薩 850002；4. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，拉薩 850002)

青稞(Hordeumvulgare. L. var.nudumHK.f.)為禾本科大麥屬，又名裸大麥、米大麥，含有豐富的β-葡聚糖、膳食纖維、支鏈淀粉，為藏族人民的主要糧食作物，其產(chǎn)量直接關(guān)系到藏區(qū)人民的經(jīng)濟(jì)和生活。青稞主要生長(zhǎng)在海拔高、溫度低、日照長(zhǎng)、晝夜溫差大的地區(qū)，對(duì)環(huán)境的抗逆性較強(qiáng)[1]。近年來(lái)，研究者先后對(duì)青稞的抗鹽性[2]和抗旱性[3]等進(jìn)行研究，以期明確青稞的抗逆機(jī)制，篩選有應(yīng)用價(jià)值的基因，為選育抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良品種提供理論依據(jù)。

類鈣調(diào)素蛋白(CaM-like protein，CML)是一類廣泛存在植物中的與鈣調(diào)素蛋白同源的Ca2+結(jié)合蛋白，通常含有1～6個(gè)結(jié)合Ca2+的EF手單元[1]。類鈣調(diào)素與鈣調(diào)素一樣，具有廣泛的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)與分裂[4-5]、調(diào)節(jié)植物開(kāi)花和自體吞噬[6-7]、調(diào)節(jié)花粉粒萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)[8-9]、參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的光信號(hào)和激素信號(hào)[10-11]，響應(yīng)ABA、鹽、紫外光、低溫等多種逆境脅迫[12-15]及調(diào)節(jié)植物對(duì)病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)[16-17]等。在擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)，CML42功能缺失突變體的表皮毛分支數(shù)增加[4]、開(kāi)花延遲[7]，CML9能夠調(diào)節(jié)ABA介導(dǎo)的脅迫應(yīng)答[12]，CML18參與鹽脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。鑒于CML蛋白功能的多樣性，筆者采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和抑制性差減雜交技術(shù)篩選青稞抗寒性相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)類鈣調(diào)素蛋白基因 CML19(GeneBank登錄號(hào)：XM_020329835)，為進(jìn)一步了解該基因的相關(guān)信息，本研究以青稞為材料，對(duì) CML19基因進(jìn)行克隆、序列分析及原核表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材 料

青稞種質(zhì)‘喜馬拉雅8號(hào)’和‘青稞320’由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供。

1.2 方 法

1.2.1 青稞種苗轉(zhuǎn)錄本的提取及反轉(zhuǎn)錄 取適量的青稞種子播種于富含有機(jī)質(zhì)的盆栽土壤中，正常澆水管理，待植株生長(zhǎng)至4葉期時(shí)，采用Jena InnuPREP RNA Mini Kit(Thermo Fisher公司)提取新鮮葉片RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit(Aidlab公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA樣本-20 ℃保存。

1.2.2 CML19基因的克隆 以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異引物CML19-F：5′-ATTGCGGGATCC- ATGGTGCACGCTGCGAC-3′和CML19- R：5′-ATTGCCCTCGAGCTACGCATCCATCATAA-CC-3′，下劃線分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。RT-PCR反應(yīng)在S-1000 Thermal Cycler進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系20 μL，包括TaqDNA聚合酶(TaKaRa，5 U/μL) 0.2 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液(Takara) 2 μL，dNTP(10 mmol/L)1.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 2 μL，滅菌水12.6 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用凝膠回收試劑盒回收目的片段，采用TaRaKa公司的DNA A-Tailing Kit加A后，連接于pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化后挑陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.2.3 CML19基因的序列分析 利用NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)的ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和Conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、DISPHOS(http://www.dabi.temple.edu/disphos/)、InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、PredictProtein(https://ppopen.rostlab.org/)、NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)等在線工具對(duì) CML19進(jìn)行序列分析。根據(jù)推測(cè)的氨基酸序列，利用MEGA5.1軟件進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析。

1.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18- CML19與表達(dá)質(zhì)粒PET28a(+)分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，凝膠回收目標(biāo)片段，使用T4DNA連接酶于16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化后挑單克隆振蕩培養(yǎng)，酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒。將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒pET28a-CML19轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，同時(shí)將空載體pET-28a(+)轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)作為陽(yáng)性對(duì)照，BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞不轉(zhuǎn)化組作為陰性對(duì)照。

1.2.5 蛋白的誘導(dǎo)及檢測(cè) 分別挑單克隆接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素100 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5時(shí)，取1 mL按體積比1∶100接種于含Kan(卡那霉素)的LB液體培養(yǎng)基中；將100 mL培養(yǎng)液分為2份，其中1份加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，另1份不加IPTG作為對(duì)照，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8 h。取IPTG誘導(dǎo)后菌液1 mL，離心，棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌后，采用超聲波破菌法分別制備總蛋白、上清和沉淀樣品，對(duì)取得的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，觀察蛋白條帶[19]。對(duì)未誘導(dǎo)菌液做同樣處理，觀察表達(dá)情況，同時(shí)將轉(zhuǎn)化pET-28a(+)的BL21作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CML19基因的克隆

以電子克隆延伸得到的序列(GeneBank登錄號(hào):XM_020329835)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異引物，以青稞苗期葉片的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得1個(gè)447 bp的cDNA片段(圖1)，測(cè)序分析顯示該片段為預(yù)期的 CML19基因CDS全長(zhǎng)(圖2)。

1～2.青稞 CML19擴(kuò)增結(jié)果 Gene amplification results of Tibetan Hulless Barley CML19;M. DNA markerⅢ

圖1青稞CML19基因凝膠電泳圖
Fig.1DNAgelblotanalysisofCML19fromTibetanHullessbarley

圖2 CML19基因測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of CML19 from Tibetan Hulless barley

2.2 CML19基因的序列分析

ORFfinder在線分析顯示， CML19基因CDS全長(zhǎng)447 bp，編碼1個(gè)含148個(gè)氨基酸的多肽(圖3)。ProtParam分析表明， CML19基因編碼的多肽分子質(zhì)量為16.46 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為4.40，分子式為C702H1114N194O232S15，總平均親水性(GRAVY)為-0.176，不穩(wěn)定系數(shù)為49.59，編碼的148個(gè)氨基酸中，包括31個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)，15個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)，其余氨基酸為非極性、疏水性氨基酸和極性、中性氨基酸，表明該蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。Disphos預(yù)測(cè)結(jié)果表明， CML19存在6個(gè)磷酸化位點(diǎn)(包括4個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn))，其中，只有1個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有功能(第26個(gè)氨基酸)。應(yīng)用InterProScan和NCBI網(wǎng)站的Conserved domains分析顯示，CML19蛋白存在典型的EF結(jié)構(gòu)域。TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白不含跨膜轉(zhuǎn)移功能區(qū)。Signal IP 4.1預(yù)測(cè)該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。PredictProtein將該基因所編碼蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。

Blastn分析發(fā)現(xiàn)， CML19基因序列與山羊草、烏拉爾圖小麥、小米和短花藥野生稻等植物的CML基因全長(zhǎng)cDNA序列的相似度分別為88%、84%、68%和68%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源比對(duì)分析結(jié)果表明，該基因編碼蛋白與山羊草、烏拉爾圖小麥、小米、短花藥野生稻的CML蛋白的相似度分別為88%、84%、68%、67%?；诎被嵝蛄械南到y(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，青稞CML19蛋白與山羊草具有較近的親緣關(guān)系(圖4)。

NPS二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，98個(gè)氨基酸屬于α-螺旋，占66.22%；9個(gè)氨基酸為延伸鏈，占6.08%；9個(gè)氨基酸屬于β-折疊，占6.08%；32個(gè)氨基酸屬于無(wú)規(guī)則卷曲，占35.02%。應(yīng)用SWISS-MODEL建立該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖5所示。

圖3 CML19基因的CDS序列和推測(cè)氨基酸序列Fig.3 CDS sequence and deduced amino acids of CML19

圖4 青稞CML19的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CML19 from Tibetan Hulless barley

A：CML19蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) The predicted secondary structure of CML19 protein; h.α-螺旋α-helix; e. 延伸鏈 Stretched chain; t.β-折疊β-sheet; c.無(wú)規(guī)則卷曲 Random coil

B：CML19蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) The predicted tertiary structure of CML19 protein

圖5CML19蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
Fig.5ThepredictedsecondaryandtertiarystructureofCML19protein

2.3 CML19基因的原核表達(dá)

利用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，得到的片段與預(yù)期大小相同(圖6)，進(jìn)一步測(cè)序分析顯示，CML19插入片段完全正確，未發(fā)生任何堿基突變。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8 h后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示融合蛋白誘導(dǎo)成功，與預(yù)期大小(16.46 ku)相近，融合蛋白主要存在于菌體沉淀中，上清中極少(圖6)，表明得到的CML19誘導(dǎo)蛋白主要以包涵體形式存在。

A:M. DNA maker; 1. pET28a- CML19雙酶切產(chǎn)物 The product from pET28a- CML19 by double enzyme digestion

B:M．標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量 Protein marker; 1. 未誘導(dǎo) Uninduced;2. 誘導(dǎo)后全菌 Whole bacteria after induced; 3. 誘導(dǎo)后上清 Supernatant of induction; 4. 誘導(dǎo)后沉淀 Precipitation of induction

圖6pET28a-CML19重組質(zhì)粒的雙酶切(A)和重組蛋白的SDS-PAGE分析(B)
Fig.6AnalysisofpET28a-CML19recombinantplasmiddigestedbydoubleenzymes(A)andSDS-PAGEoftheexpressedprotein(B)

3 討 論

中國(guó)是大麥的起源地之一，種質(zhì)資源極為豐富，尤其是裸粒類型占有特別突出的地位，裸大麥在中國(guó)西藏、青海等地常稱為“青稞”。青稞具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和突出的醫(yī)藥保健作用。在高寒缺氧的青藏高原，不乏百歲老人，這與常食青稞及青稞突出的醫(yī)療保健功能是分不開(kāi)的。和其他作物一樣，現(xiàn)代青稞選育亦是以高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗逆為主要目標(biāo)，因此研究其遺傳背景對(duì)于選育高產(chǎn)優(yōu)產(chǎn)抗寒的農(nóng)作物具有重要意義。

植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)不是相互孤立, 而是緊密聯(lián)系的。不良環(huán)境條件引起植物產(chǎn)生的生理反應(yīng)有利于植物適應(yīng)環(huán)境脅迫以完成整個(gè)生命周期。其中，Ca2+信號(hào)在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過(guò)程中具有重要作用，由于植物生長(zhǎng)的環(huán)境具有動(dòng)態(tài)變化和充滿脅迫的特點(diǎn), 鈣感受器的多樣性和豐富性可能對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和生殖的順利完成至關(guān)重要。CML 作為一類鈣感受器, 對(duì)其生理功能的研究有助于明晰 Ca2+信號(hào)介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并解答鈣感受器如何解讀鈣信號(hào)并產(chǎn)生特異性反應(yīng)?；蛐酒然虮磉_(dá)數(shù)據(jù)表明，很多CML基因?qū)Ω鞣N非生物脅迫都有不同程度的響應(yīng)[1,13-15]，如擬南芥 CML6、CML17、CML28、CML37、CML40、CML44和 CML50等受鹽和干旱誘導(dǎo)， CML8、CML13、CML18和 CML25等受鹽和干旱抑制[1,13,20]。水稻CML基因 OsMSR2也受多種非生物脅迫誘導(dǎo)，而且過(guò)量表達(dá) OsMSR2使轉(zhuǎn)基因植物對(duì)ABA 的敏感性增強(qiáng)，對(duì)鹽和干旱的抗性也增強(qiáng)[1, 21]。人們發(fā)現(xiàn) CML19功能敲除突變體cml19 以及 CML19沉默的突變體對(duì)UV脅迫都更敏感，并且它們?cè)隗w外DNA 損傷修復(fù)的效率都降低，而過(guò)量表達(dá) CML19使植物DNA 損傷的修復(fù)增強(qiáng)[1, 22]。進(jìn)一步研究表明，UV 脅迫促進(jìn)CML19蛋白的表達(dá)，而且UV脅迫使CML19 從細(xì)胞質(zhì)快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核[1, 23]。本試驗(yàn)克隆得到的青稞CML19的功能尚不清楚，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和抑制性差減雜交技術(shù)篩選青稞抗寒相關(guān)基因的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)， CML19包含其中，推測(cè)其與青稞的抗寒性相關(guān)。因此，需要對(duì) CML19基因進(jìn)一步克隆和序列分析，同時(shí)進(jìn)行原核表達(dá)，探究其在體外的表達(dá)情況，為研究CML19蛋白與青稞的抗寒性奠定基礎(chǔ)。