一株石油降解菌Lysinibacillus fusiformis 23-1的篩選鑒定及原油降解特性

李國麗，曾小英，翟立翔，冷 艷，劉夢圓，李師翁，，*，陳 拓

(1.蘭州交通大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070; 2.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室/中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 沙漠與沙漠化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

石油泄露危害環(huán)境和人體健康，給國家、社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和健康隱患[1-2]。處理石油烴污染的方法有化學(xué)法、物理法和生物法[3]。物理法是使用處理設(shè)備如圍墻、圍欄、撇油器、吸附材料來回收殘留油?；瘜W(xué)處理法是通過添加一些分散劑和其他化學(xué)制品改變石油的物化性質(zhì)，加速石油分解。但是傳統(tǒng)的物理、化學(xué)法去除石油效果不太明顯，由于后期還需對含油廢物做進一步處理，這又增加了成本費用[4]。而生物修復(fù)是通過微生物自身或微生物的代謝產(chǎn)物將石油污染物轉(zhuǎn)化為無毒無害或者毒性較低的化合物，其中最理想的產(chǎn)物是二氧化碳和水[5]。微生物修復(fù)具有操作簡單、除油率高、適應(yīng)性強、繁殖快、種類多等優(yōu)勢，因此篩選高效的原油降解菌受到人們的廣泛關(guān)注[6]。

Atlas[7]研究發(fā)現(xiàn)，降解烴類的微生物占總微生物群落的1%，當有烴類污染物存在時，降解烴類的微生物會迅速增加到10%。據(jù)統(tǒng)計，降解烴類污染物的微生物大約有120余屬、300多種，微生物種類包括細菌、放線菌、酵母菌、霉菌等，目前研究最多的是假單胞菌和枯草芽孢桿菌[8]。1949年，研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)表面活性劑鼠李糖脂，該表面活性劑不僅具有乳化、增溶、降低表界面張力等功能，而且具有毒性小、易于生物降解等優(yōu)點，因而在原油開采、醫(yī)藥、食品、日化及環(huán)境保護等許多領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力[9]。1968年Arima等[10]首次發(fā)現(xiàn)的由枯草芽孢桿菌發(fā)酵獲得的表面活性素，后來經(jīng)鑒定為脂肽類表面活性劑，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最好的脂肽類表面活性劑之一。

本研究從青藏高原祁連山寶瓶河石油污染土樣中篩選出菌株Lysinibacillusfusiformis23-1，同時研究了該菌株的乳化特性、乳化穩(wěn)定性、降解石油特性，以及該菌株降解不同碳鏈烴類的特性，并研究了該菌株的最適石油降解條件。

1 材料與方法

1.1 材料來源

菌株分離土壤樣品取自青藏高原祁連山寶瓶河(海拔2 606 m，100°17.78 E，38°24.01 N) 石油污染土樣，實驗中所用石油樣品來自中國石油蘭州石化公司。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：216L培養(yǎng)基[11]。

復(fù)篩培養(yǎng)基：血液瓊脂基礎(chǔ)45 g，無菌脫纖維羊血50 mL，加入1 L蒸餾水，pH 7.2～7.4[12]。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，NaNO31.0 g，(NH4)2SO41.0 g，Na2HPO41.2 g，K2HPO41.0 g，Mg2SO4·7H2O 0.01 g，加蒸餾水至1 L，pH 6.8～7.0(不加瓊脂)[13]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：MM培養(yǎng)基[11]。

1.3 初篩

稱取5 g污染土樣溶于無菌生理鹽水20 ℃振蕩30 min，吸取400 μL懸液加入到2%石油為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中進行富集，富集條件為20 ℃，180 r·min-1振蕩富集培養(yǎng)5 d，取振蕩培養(yǎng)液0.1 mL均勻涂布到以石油為唯一碳源的216L培養(yǎng)基平板上，在20 ℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d后篩選菌株，將篩選到的菌株用25%的甘油保存于-80 ℃冰箱中[14]。

1.4 復(fù)篩

由于生物表面活性劑具有溶血性，所以采用血平板進行復(fù)篩，將保存的菌株活化后，制備菌懸液，吸取10 μL菌懸液在復(fù)篩培養(yǎng)基上20 ℃培養(yǎng)2 d。然后對菌落周圍的透明圈和菌落大小分別測量其直徑，并比較大小，根據(jù)比值篩選出產(chǎn)表面活性劑較強的菌株，然后對該菌株進行進一步研究。

1.5 石油降解菌株的鑒定

以菌株基因組DNA為模板，通用引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')[15]。PCR擴增體系為：10×Taq緩沖液2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，25 mmol·L-1MgCl23 μL，5 UTaqDNA聚合酶 (Promega，Madison，Wis.，USA)，引物各10 pmol，進行16S rRNA基因擴增。PCR擴增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸20 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)電泳檢測，擴增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行序列測定。將基因序列提交至GenBank并進行Blast相似性搜索，獲得相似菌株序列用軟件MEGA5.0以neighbor-joining method構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 石油降解菌株生長曲線的測定

將獲得的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，20 ℃，180 r·min-1振蕩48 h，無菌生理鹽水調(diào)D600=0.6，吸取200 μL種子液接種至已滅菌含有20 mL的216L培養(yǎng)基的三角瓶中，每隔4 h測定D600記錄并繪制曲線，以不加種子液的216L培養(yǎng)基為對照[16]。

1.7 石油降解菌株乳化力的測定

離心管中加入4 mL石蠟和4 mL 培養(yǎng)3 d的發(fā)酵液，設(shè)置3個平行和空白對照，用KQ-250B型超聲波儀于80 W下超聲15 min，然后避光靜置，用三氯甲烷萃取乳化層中的油，測定萃取液的光密度，在標準曲線上找到對應(yīng)的乳化油量，計算得到乳力的大小[17]。

標準曲線的繪制：稱取石蠟0.5 g，用三氯甲烷稀釋至100 mL，分別吸取1、2、3、4、5、6 mL各稀釋至50 mL。根據(jù)所測得的6個光密度值與已知油量繪制標準曲線，并據(jù)此計算乳化力[18]。

1.8 石油降解率的測定

將菌株23-1接種于種子培養(yǎng)基中，取對數(shù)期菌液離心，棄上清，用無菌生理鹽水調(diào)D600=0.6，吸取200 μL稀釋液到以2%石油為唯一碳源的MM培養(yǎng)基中，20 ℃，180 r·min-1振蕩7 d。然后測定D600來表征生長情況[19]。采用質(zhì)量法[11]測定石油降解率，該方法已被廣泛應(yīng)用[20]，設(shè)空白對照，3個重復(fù)。

1.9 石油降解菌株的特性

同質(zhì)量法相似，將石油醚替換為正己烷，用量相同，待靜置分層后用無水Na2SO4脫水，用0.2 μm的濾膜過濾，將過濾后的有機相進行GC-MS分析。色譜條件：色譜柱為Varian(30 m×0.25 mm ×0.25 μm)石英毛細管柱；檢測器溫度為280 ℃，升溫程序：60 ℃恒溫2 min，以升溫速率為8 ℃·min-1升溫到280 ℃，恒溫5 min；載氣(N2)流量為1 mL·min-1；進樣口溫度為270 ℃；進樣量為2 μL；分流體積比為20∶1[21-22]。

1.10 菌株對不同碳鏈烴類的利用譜

提前將菌株23-1用高壓滅菌的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)期菌液2 mL，于室溫條件下6 000 r·min-1離心5 min，用無菌生理鹽水調(diào)整初始濃度測定D600=1.0，采用無菌100 mL三角瓶加入20 mL MM培養(yǎng)基，接種1%D600=1.0的稀釋液，分別添加碳鏈為C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C22、C24、C28、C32、C36的烴類和萘、環(huán)己烷、苯酚為碳源，加入量為1 g·L-1或者1 mL·L-1，如常溫下為晶體的碳源，則需要提前預(yù)熱為液體再加入，然后于搖床25 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)，測定不同培養(yǎng)時間的D600[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩與復(fù)篩

從青藏高原祁連山寶瓶河采集原油污染的土樣，在20 ℃條件下分離到能夠在以2%石油為唯一碳源的MM培養(yǎng)基中生長的34株菌。通過血平板復(fù)篩比較透明圈與菌落的直徑大小，篩選1株產(chǎn)表面活性劑能力最強的菌株，菌株編號為23-1。菌培養(yǎng)3 d后菌落形態(tài)為圓點形，淡黃色，表面濕潤光滑，邊緣規(guī)則(圖1-A)。在血平板上的透明圈與菌落直徑比為2.5∶1.5(圖1-B)，革蘭氏陽性桿狀菌(圖1-C、D)。

2.2 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

依據(jù)測序結(jié)果，將菌株23-1的16S rRNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KT369958，與數(shù)據(jù)庫中已有序列進行相似性比對分析，結(jié)果顯示，該菌株與模式菌株LysinibacillusfusiformisB10/1/VF的相似性均高達99.9%。菌株23-1的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖1 菌落形態(tài)(A)、降解圈(B)、革蘭氏染色(C)和掃描電鏡下菌株形態(tài)(D)Fig.1 Colony morphology (A)， transparent zone on the blood plate (B)， Gram staining (C) and SEM photo (D)

2.3 菌株L. fusiformis 23-1在石油為碳源培養(yǎng)基中的生長曲線

以D600為指標的生長曲線表明，菌株L.fusiformis23-1在以石油為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中20 h后進入對數(shù)生長期，生長速度較快，生長情況良好；72 h后進入穩(wěn)定生長期，生長量較高，120 h后進入衰退期(圖3)。

2.4 菌株L. fusiformis 23-1乳化力

根據(jù)乳力標準曲線y=1.2851x+0.1665，R2=0.9625，計算L.fusiformis23-1乳化力為19.6%，通過超聲波處理，乳化層與液體總高度比是3∶8，乳化穩(wěn)定性為37.5%。刻度管中從上到下依次為液體石蠟、乳化層、發(fā)酵液。乳化層出現(xiàn)乳白色小球顆粒，靜置一段時間后，乳白色小球消失，乳化層分離明顯(圖4)。

圖2 菌株23-116S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain 23-1 based on 16S rRNA sequences

圖3 Lysinibacillus fusiformis 23-1的生長曲線Fig.3 Growth curve of the Lysinibacillus fusiformis 23-1

2.5 菌株L. fusiformis 23-1石油降解率

通過質(zhì)量法測定結(jié)果表明，在以2%石油為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株L.fusiformis23-1對石油總降解率為57%(圖5)。

將菌株L.fusiformis23-1在以2%石油為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中20 ℃振蕩8 d后，用正己烷洗滌，然后收集有機相，再用適量無水Na2SO4脫水，進行GC-MS測定分析，空白作對照，發(fā)現(xiàn)原油中的石油烴被不同程度地降解(圖6)。

圖4 空白對照(A)與Lysinibacillus fusiformis 23-1(B)乳化力測定Fig.4 Determination of emulsifying power of the control (A) and Lysinibacillus fusiformis 23-1 (B)

圖5 Lysinibacillus fusiformis 23-1對石油的降解及對照實驗結(jié)果Fig.5 Petroleum degradation by Lysinibacillus fusiformis 23-1 and the control experiment

A， 降解前石油組分；B，L. fusiformis 23-1降解后石油組分。A， Petroleum components before degradation; B， Petroleum components after degradation by L. fusiformis 23-1.圖6 石油經(jīng)菌株Lysinibacillus fusiformis 23-1降解前后的GC分析結(jié)果Fig.6 GC analysis of petroleum components after degradation by Lysinibacillus fusiformis 23-1

通過GC峰面積計算表明，菌株L.fusiformis23-1對石油中各類烴具有不同程度的降解，C12-C28的直鏈飽和烷烴降解率達到99%以上，C11-C23的支鏈烷烴的降解率較弱為85%左右，對短鏈烷烴、長鏈烷烴以及芳香烴的利用能力較差，這與已經(jīng)報道的結(jié)果相一致[24]。

圖7 菌株Lysinibacillus fusiformis 23-1對石油中不同烴的降解率Fig.7 Degradation rates of various kinds of hydrocarbons in the petroleum by Lysinibacillus fusiformis 23-1

L.fusiformis23-1能利用不同直鏈烷烴和環(huán)烷烴作為唯一碳源和能源，培養(yǎng)不同時間后測定菌液D600，結(jié)果如圖8、圖9所示，菌株L.fusiformis23-1能夠較好地利用C14-C28，對短鏈烷烴的C6、C8、C10，以及長鏈烷烴的C32、C36的降解率較差；對芳香烴的利用結(jié)果表明，該菌可利用環(huán)己烷，對萘和苯酚幾乎不利用。

2.6 培養(yǎng)條件對菌株L. fusiformis 23-1石油降解率的影響

2.6.1 培養(yǎng)時間

吸取200 μL培養(yǎng)至D600=0.6的菌株23-1菌懸液接種于含有2%石油的發(fā)酵培養(yǎng)基中，20 ℃、180 r·min-1分別振蕩培養(yǎng)1～9 d，分別測定石油降解率和D600。當培養(yǎng)至第3天時，凝結(jié)成塊的石油團開始分散成小球狀，L.fusiformis23-1對石油的降解率從第4天開始快速升高，隨著時間的延長菌株對石油的降解率逐步提高，到第7天時降解率最大(圖10)。通過D600表征得知，當菌株進入對數(shù)后期，對石油降解率保持在穩(wěn)定水平，表明L.fusiformis23-1的生長情況與對石油的降解呈正相關(guān)[25]。

圖8 菌株Lysinibacillus fusiformis 23-1利用不同碳數(shù)直鏈烷烴的生長能力Fig.8 Growth of strain Lysinibacillus fusiformis 23-1 using straight-chain alkanes

圖9 菌株Lysinibacillus fusiformis 23-1利用三種環(huán)烷烴的生長能力Fig.9 Growth of strain Lysinibacillus fusiformis 23-1 using three kinds of cycloalkane

2.6.2 溫度

同上述方法將L.fusiformis23-1在5、10、15、20、25、30、35 ℃分別培養(yǎng)8 d，測定其對石油的降解率和D600。結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對L.fusiformis23-1的石油降解率影響較明顯(圖11)。在低于15 ℃時，發(fā)酵液較清透，油水界限分明，質(zhì)量法測定的石油降解率為57%，表明該菌株在低溫下具有一定的石油降解能力；隨著溫度的升高，菌株的生長繁殖活躍，石油降解能力提升，發(fā)酵液變渾濁，成片油膜減少，出現(xiàn)小珠狀油粒。在20 ℃時菌株對石油的降解率為47%，25 ℃時菌株的生長量達到最大，并且石油降解率達到最高，為57%。

圖10 培養(yǎng)時間對Lysinibacillus fusiformis 23-1石油降解率的影響Fig.10 Effect of culture duration on the petroleum degradation rates of Lysinibacillus fusiformis 23-1

圖11 溫度對Lysinibacillus fusiformis 23-1石油降解率的影響Fig.11 Effect of temperature on petroleum degration rates of Lysinibacillus fusiformis 23-1

2.6.3 pH

同上述方法將L.fusiformis23-1在pH 5.5、6.5、7.5、8.5下分別培養(yǎng)8 d，然后測定其石油降解率和D600。結(jié)果表明，L.fusiformis23-1在石油為碳源的培養(yǎng)基上生長的最適pH為7.5左右，在該pH值時獲得的最大石油降解率為57% (圖12)。有研究也表明，在pH弱堿性時，微生物能夠更好地利用磷，促進微生物代謝，從而加快原油的降解[26]。

圖12 pH值對菌株Lysinibacillus fusiformis 23-1石油降解率的影響Fig.12 Effect of pH value on petroleum degradation rates of Lysinibacillus fusiformis 23-1

3 討論

微生物對石油組分的降解難易程度順序為：直鏈烷烴﹥支鏈烷烴﹥小分子芳香烴﹥大分子芳香烴和環(huán)烷烴[24]。有關(guān)石油降解菌的研究已有較多報道，其中以枯草芽孢桿菌屬和假單胞菌屬研究較多[8]，而關(guān)于紡錘形賴氨酸芽孢桿菌(L.fusiformis)降解石油的研究還未見報道。本實驗從青藏高原祁連山寶瓶河流域獲得石油污染土樣，獲得一株產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌株L.fusiformis23-1，可以利用石油作為唯一碳源進行代謝，石油降解率為57%，該菌的乳化性能和乳化穩(wěn)定性結(jié)果顯示可降低油水界面張力，具有增溶作用，可促進石油降解，采用GC-MS方法結(jié)果顯示，菌株L.fusiformis23-1對石油中烴都具有不同程度的降解，主要利用中長鏈烷烴和支鏈烷烴，對短鏈烷烴、長鏈烷烴以及芳香烴的利用能力較弱，這與已經(jīng)報道的結(jié)果相一致[27]。

依據(jù)不同培養(yǎng)時間對單一碳源的利用情況的研究表明，該菌株能快速利用C12、C16、C18、C22、C24，這與Zampolli等[23]的研究結(jié)果相符，對不同環(huán)烷烴的利用結(jié)果表明，與萘和苯酚相比較，該菌株可以較好利用環(huán)己烷，這和其他已發(fā)現(xiàn)的降解環(huán)己烷的菌株結(jié)果是一致的[29]。L.fusiformis23-1的單因素試驗得到該菌的最佳發(fā)酵時間為8 d，最佳溫度25 ℃，最適pH 7.5，在該條件下降解率達到最大值。篩選到的L.fusiformis23-1不僅能夠適應(yīng)含油環(huán)境，而且能夠產(chǎn)生表面活性劑，對處理常年石油污染地域的生物修復(fù)具有重要的意義。