積雪草酸對(duì)高血脂小鼠骨量丟失的保護(hù)作用

吳少科 陳曉駟 孫欣 陳海聰 林柏云 鐘環(huán) 胡資兵* 魏波 孫文皋

1. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨外科，廣東 湛江 524023 2. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院VIP病區(qū)，廣東 湛江 524023

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨代謝性疾病，其特征是低骨量、骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加。高脂血癥是指一種發(fā)病隱匿的、進(jìn)行性和全身性疾病，表現(xiàn)為總膽固醇過(guò)高、甘油三酯過(guò)高或兩者兼有，在中國(guó)成年人的人群里，其發(fā)病率約為41.9%[1]。有研究表明，骨量丟失或骨質(zhì)疏松的患者常常伴隨著高血脂[2]，去卵巢的大鼠或絕經(jīng)后的婦女出現(xiàn)骨量的丟失，隨之血脂水平也升高[3]，并且降血脂的藥物也能明顯減緩高血脂所致的骨量丟失[4]，因此，高血脂在OP的發(fā)生與發(fā)展中起到重要作用。

積雪草酸是傘形科植物積雪草中的一種重要的五環(huán)三萜酸類(lèi)化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1，積雪草廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南的陰濕地區(qū)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)用積雪草外用及內(nèi)服治病已有兩千多年歷史，近年來(lái)，隨中藥的研究發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)積雪草酸具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤和促進(jìn)傷口愈合等多種作用[5]。國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于積雪草酸在抗氧化和降血脂方面的報(bào)道[6]，并且近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)積雪草酸具有抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的能力[7]。因此，本研究猜測(cè)積雪草酸有可能減緩高血脂導(dǎo)致的骨量丟失，另外，目前在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)有關(guān)積雪草酸在防治高血脂性骨質(zhì)疏松癥方面的研究報(bào)道。所以，本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)積雪草酸對(duì)高血脂大鼠骨量丟失的保護(hù)作用，初步闡明其作用機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療高血脂性骨質(zhì)疏松癥的新藥提供理論依據(jù)。

圖1 積雪草酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The chemical structure of the asiatic acid

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

積雪草酸(Asiatic acid，AA，純度≥95%，UP-LC/UV)采購(gòu)于廣西昌洲天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)有限公司(批號(hào)：160102)，辛伐他汀片生產(chǎn)于上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司(Simvastatin，SIM，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19980055)，普通飼料(含64%碳水化合物，10%脂肪和26%蛋白質(zhì))和高脂飼料(含28%碳水化合物，60%脂肪和12%蛋白質(zhì))采購(gòu)于南通特洛菲飼料科技有限公司。低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)檢測(cè)試劑盒、I型膠原C末端肽(C-terminal telopeptides of type I collagen, CTX-I)Elisa試劑盒、I型前膠原氨基端前肽(N-terminal propeptide of type I procollagen, PINP)Elisa試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物分組、造模及給藥

8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6 J小鼠60只，28.0±4.7 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)于室溫24～28℃，相對(duì)濕度為55%～65%，每天12 h照明，12 h黑暗，自由飲用自來(lái)水。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)動(dòng)物的處置符合科技部《關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》要求。小鼠按體重隨機(jī)分成6組，每組10只：①空白對(duì)照組[CON, 生理鹽水：5 mL/(kg·d)]、②高脂飼料組[HFD, 生理鹽水：5 mL/(kg·d)]、③高脂飼料+低劑量積雪草酸組[HFD+AA-L：5 mg/(kg·d)]、④高脂飼料+中劑量積雪草酸組[HFD+AA-M：10 mg/(kg·d)]、⑤高脂飼料+高劑量積雪草酸組[HFD+AA-M：20 mg/(kg·d)]、⑥高脂飼料+辛伐他汀組[HFD+SIM：20 mg/(kg·d)]。

除了CON組給予小鼠普通飼料喂養(yǎng)，其他組別均給予小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，自由攝食飼料。采用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)16周建立小鼠骨量丟失模型[8]，并同時(shí)采用積雪草酸水溶液和辛伐他汀水溶液灌胃給藥進(jìn)行干預(yù)，每2周稱(chēng)量小鼠體重1次，并根據(jù)體重變化調(diào)整給藥劑量。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前第14、13、4天和3天對(duì)全部小鼠的頸部皮下避光注射鈣黃綠素(5 mg/kg)，在小鼠骨組織中骨小梁表面形成綠色雙熒光標(biāo)記，兩次熒光標(biāo)記間隔時(shí)間為10 d。在熒光顯微鏡下，沉積在骨表面的鈣黃綠素呈綠色熒光。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行16周后處死小鼠。收集血清、內(nèi)臟及雙側(cè)脛骨和股骨。

1.3 血清中血脂指標(biāo)、氧化活性指標(biāo)檢測(cè)和肝腎毒性檢測(cè)

采用分光光度計(jì)檢測(cè)小鼠血清TC、TG、LDL、SOD和MDA水平，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 血清中骨轉(zhuǎn)換代謝指標(biāo)檢測(cè)

用試劑盒檢測(cè)小鼠血清CTX-I和PINP水平，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 Micro-CT測(cè)量骨組織骨微結(jié)構(gòu)

將左脛骨表面的肌肉剔除干凈后，于左脛骨中間處鋸斷，將脛骨上段垂直固定于特定的樣品固定器內(nèi)，行Micro-CT三維掃描，掃描完成后，三維重建區(qū)域定位均在距左脛骨生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端0.5 mm、層厚2 mm骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域，選取具體參數(shù)如下：X線能量70kVp，114μA；掃描模式BH：ALU；掃描分辨率0.038 mm，2048×2048，曝光時(shí)間200 ms，以最低閾值為220提取圖像信息，獲取重建圖像后，使用Micro-CT自帶的軟件進(jìn)行定量分析。松質(zhì)骨的定量參數(shù)包括：骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)。定性3D圖包括：分段圖像(segmented image，SEG image)、分離圖(separation image，SP image)和厚度圖(thickness image，TH image)。

1.6 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)

分離小鼠脛骨，右脛骨用低速鋸鋸開(kāi)取脛骨上段，用甲基炳烯酸甲脂包埋做不脫鈣骨切片，4 μm切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，測(cè)定成骨細(xì)胞表面百分比和破骨細(xì)胞表面百分比(Ob.S/BS和Oc.S/BS)。8 μm切片直接在顯微鏡觀察其骨組織熒光，測(cè)定骨組織動(dòng)態(tài)參數(shù)，包括礦化沉積率(mineral apposition rate, MAR)、骨表面骨形成率(bone surface bone formation rate, BFR/BS)、新生骨小梁面積和骨小梁總面積比值(BFR/BV)。

1.7 股骨生物力學(xué)檢測(cè)

分離小鼠左股骨，將左股骨表面的肌肉剔除干凈后，放進(jìn)裝有50%乙醇-生理鹽水的10 mL EP管里。樣本包裝好送往上海生物力學(xué)研究所進(jìn)行骨生物力學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)儀器：生物力學(xué)測(cè)試儀器QW-W600。儀器將及時(shí)記錄出每個(gè)時(shí)刻點(diǎn)的載荷和橈度變化值，繪制出載荷-位移曲線，然后讀取最大載荷(maximum load)、斷裂載荷(fracture load)和彈性載荷(elastic load)，并計(jì)算剛度(stiffness)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重的變化

在喂養(yǎng)16周過(guò)程里，HFD組小鼠的體重增速高于CON組小鼠，在12～16周中，與CON組小鼠相比，HFD組小鼠的體重明顯增加(P<0.05)，而各濃度的治療組小鼠體重變化無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同組別小鼠體重變化的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.2 Comparison of the body weight of mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.2 各組小鼠血清血脂指標(biāo)

HFD組小鼠血清中TC水平明顯高于CON組(P<0.05)，而TG和LDL水平差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。除HFD+AA-L組之外，HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠血清中TC水平比HFD組顯著降低(P<0.05)，且這三者的效果相當(dāng)(P>0.05)，而各濃度治療組小鼠血清TG和LDL水平比HFD組則差異均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同組別小鼠血清膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.3 Comparison of the concentrations of TC, TG, and LDL in the serum of mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.3 各組小鼠血清抗氧化指標(biāo)

與CON組小鼠相比，HFD組小鼠血清SOD水平明顯下降(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)。與HFD組小鼠相比，除了HFD+AA-L組小鼠之外，HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠血清SOD水平顯著升高(P<0.05)，而MDA水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同組別小鼠血清SOD和MDA的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.4 Comparison of the levels of SOD and MDA in the serum of mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.4 各組小鼠血清骨轉(zhuǎn)換代謝指標(biāo)

與CON組小鼠相比，HFD小鼠血清骨形成指標(biāo)PINP水平顯著下降(P<0.05)，骨吸收指標(biāo)CTX-I水平顯著升高(P<0.05)。除了HFD+AA-L組小鼠之外，HFD+AA-M、 HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠血清PINP水平均比HFD組顯著升高(P<0.05)，而血清CTX-I水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同組別小鼠血清PINP和CTX-I的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.5 Comparison of the levels of PINP and CTX-I in the serum of mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.5 各組小鼠脛骨近端松質(zhì)骨的micro-CT 3D圖

micro-CT的3D圖能說(shuō)明不同組別小鼠脛骨近端松質(zhì)骨的形態(tài)變化情況。

從SEG圖可見(jiàn)：CON組小鼠骨小梁數(shù)目多，厚度較厚，排列緊密，性狀規(guī)則；HFD組小鼠骨小梁數(shù)目減少，厚度變薄，骨微結(jié)構(gòu)受損，完整的微觀構(gòu)筑受到破壞；HFD+AA-L組小鼠骨微結(jié)構(gòu)改善不明顯，有部分空洞；HFD+AA-M組小鼠骨小梁數(shù)目較HFD組增多，排列較均勻，骨微結(jié)構(gòu)有明顯改善；HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠骨小梁數(shù)目較HFD組增多，厚度增厚，排列緊密，骨微結(jié)構(gòu)有明顯改善。

從SP圖可見(jiàn)：CON組小鼠松質(zhì)骨上段骨小梁紅色、橙色和黃色區(qū)域分布較少，由于骨小梁分離度顏色從藍(lán)黑色、綠色、黃色、橙色到紅色，代表分離度越來(lái)越大，CON組松質(zhì)骨上段骨小梁絕大部分是藍(lán)綠色和綠色，提示CON組小鼠骨小梁分離度較低，骨小梁排列緊密。HFD組小鼠松質(zhì)骨上段骨小梁紅色、橙色和黃色區(qū)域分布增多，特別紅色和橙色區(qū)域分布面積增加最明顯，提示HFD組小鼠骨小梁分離度增加，骨微結(jié)構(gòu)存在空洞。HFD+AA-M、 HFD+AA-H和HFD+SIM組小鼠松質(zhì)骨上段骨小梁紅色、橙色和黃色區(qū)域分布較少，提示其骨小梁分離度較低，排列較緊密，間隙較窄，HFD+AA-L組小鼠松質(zhì)骨上段骨小梁紅色、橙色和黃色區(qū)域面積分布一定程度有減少趨勢(shì)，但是改善的程度并無(wú)HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組明顯。

從TH圖可見(jiàn)：CON組小鼠鼠松質(zhì)骨上段骨小梁綠色區(qū)域分布較多，由于骨小梁厚度顏色從從藍(lán)黑色、綠色、黃色、橙色到紅色，代表厚度越來(lái)越薄，這提示CON組小鼠骨小梁厚度較大；HFD組小鼠松質(zhì)骨上段骨小梁紅色和橙色區(qū)域分布多，提示HFD組小鼠骨小梁厚度變??；與HFD組相比，除HFD+AA-L組之外，其余各組小鼠綠色和黃色區(qū)域分布均有所增加，提示其骨小梁厚度有增加，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同組別小鼠脛骨近端松質(zhì)骨的micro-CT 3D圖Fig.6 3D images of micro-CT of the trabecular bone in the proximal tibia in mice among different groups

2.6 各組別小鼠脛骨近端松質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)

與CON組相比，HFD組小鼠脛骨近端松質(zhì)骨骨密度(bone mineral density, BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction, BV/TV)、骨小梁數(shù)目(trabecular number, Tb.N)和骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)均顯著下降(P<0.05)，骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)升高(P<0.05)。與HFD組相比，HFD+AA-L組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp無(wú)明顯變化(P>0.05)；HFD+AA-M組BMD、BV/TV和Tb.N均增加(P<0.05)，Tb.Sp下降(P<0.05)，但Tb.Th無(wú)明顯變化(P>0.05)；HFD+AA-H組BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均增加(P<0.05)，但Tb.Sp有下降趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HFD+SIM組BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均顯著升高(P<0.05)，Tb.Sp下降(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同組別小鼠血清脛骨近端松質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.7 Comparison of the parameters of trabecular bone microstructure of the proximal tibias in mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.7 各組別小鼠骨組織形態(tài)學(xué)和形態(tài)計(jì)量學(xué)的變化

在熒光顯微鏡下，CON組骨組織熒光強(qiáng)、多且清晰，雙熒光標(biāo)記的間距較寬，而HFD組的熒光標(biāo)志稀少，熒光強(qiáng)度顯著減弱。HFD+AA-L組較HFD組熒光標(biāo)志稍多，熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)但是不明顯；HFD+AA-M組熒光標(biāo)志明顯增多，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；HFD+AA-H和HFD+AA-SIM組熒光標(biāo)志顯著增多，雙熒光標(biāo)志的間距較寬，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)圖8。

與CON組相比，HFD組的骨小梁Ob.S/BS、MAR、BFR/BS和BFR/BV均顯著下降(P<0.05)，Oc.S/BS升高(P<0.05)。與HFD組相比，HFD+AA-L組Ob.S/BS、Oc.S/BS、MAR、BFR/BS和BFR/BV無(wú)明顯變化(P>0.05)；HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組Ob.S/BS、Oc.S/BS、MAR、BFR/BS和BFR/BV有明顯變化，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖8 不同組別小鼠脛骨上段熒光圖(×100)Fig.8 Fluorescence images of the proximal tibia of mice among different groups (×100)

圖9 不同組別小鼠脛骨近端松質(zhì)骨的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)參數(shù)的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.9 Comparison of histomorphometry parameters of trabecular bone of the proximal tibia in mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

2.8 各組別小鼠股骨骨生物力學(xué)檢測(cè)

與CON組相比，HFD組股骨骨生物力學(xué)maximum load、elastic load、fracture load和stiffness均顯著下降(P<0.05)。與HFD組相比，HFD+AA-L組maximum load、elastic load、fracture load和stiffness均無(wú)明顯變化，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。HFD+AA-M、HFD+AA-H和HFD+SIM組maximum load、elastic load、fracture load和stiffness均顯著提高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 不同組別小鼠股骨骨生物力學(xué)的比較注：與CON組比較，*P<0.05；與HFD組相比，#P<0.05Fig.10 Comparison of the value of biomechanical indexes of the femur in mice among different groupsNote：*P<0.05 vs CON; #P<0.05 vs HFD

3 討論

高脂血癥與骨質(zhì)疏松癥是我國(guó)老齡化社會(huì)的多發(fā)病和常見(jiàn)病，它們之間存在密切的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松常常會(huì)伴發(fā)血脂代謝異常[9]，而治療骨質(zhì)疏松的期間，血脂代謝異常往往也得以改善和逆轉(zhuǎn)[10]，當(dāng)脂質(zhì)代謝紊亂時(shí)又會(huì)進(jìn)一步加重骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[11]，雖然血脂代謝異常影響骨量的機(jī)制尚未清楚，但是多大數(shù)研究報(bào)道顯示，高血脂患者體內(nèi)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化增多，而導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化減少，其機(jī)制可能是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的PPARy基因表達(dá)過(guò)多[12]，另外，也可能高血脂癥抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和骨鈣素基因表達(dá)，從而使骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化降低，造成骨質(zhì)疏松癥[8,13]。另一方面，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與高脂血癥機(jī)體里抗氧化機(jī)制的失調(diào)關(guān)系十分密切，因?yàn)檠x紊亂會(huì)造成機(jī)體氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而刺激破骨細(xì)胞數(shù)目增加，下調(diào)Wnt通路的相關(guān)成骨分化的基因表達(dá)來(lái)減少成骨細(xì)胞數(shù)量[14,15]，導(dǎo)致骨量丟失，進(jìn)一步促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予高脂飼料喂養(yǎng)可致小鼠表現(xiàn)為體重增加、血清TC水平明顯升高，該研究結(jié)果與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道具有一致[8,16]，提示高脂飼料造成小鼠出現(xiàn)單純性高TC血癥。大多數(shù)研究報(bào)道，高脂飲食會(huì)引起小鼠骨量丟失，尤其松質(zhì)骨的丟失顯得更明顯[17,18]，本實(shí)驗(yàn)的Micro-CT結(jié)果也證實(shí)了給予高脂飼料會(huì)造成小鼠的松質(zhì)骨骨密度下降和骨小梁骨微結(jié)構(gòu)受損，然而其相關(guān)發(fā)病機(jī)制，有研究者發(fā)現(xiàn)高脂飲食對(duì)小鼠的成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞功能具有不同的影響，其中，Cao等[18]發(fā)現(xiàn)給予高脂飲食后，小鼠出現(xiàn)骨量丟失，并且其成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化能力均增強(qiáng)，同樣也有研究[19]報(bào)道，經(jīng)高脂飲食后，小鼠的骨髓細(xì)胞里的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)目明顯增加。與其產(chǎn)生不一致的結(jié)果的是，Patsch等[20]發(fā)現(xiàn)給予高脂飲食喂養(yǎng)可導(dǎo)致小鼠血清骨吸收指標(biāo)水平升高，骨形成指標(biāo)水平無(wú)明顯變化。因此，出現(xiàn)以上的矛盾結(jié)果可能與不同的動(dòng)物類(lèi)型、不同的造模方法和時(shí)間，尤其是不同的評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的方法有密切關(guān)系。本研究通過(guò)給予含有60%脂肪的高脂飼料喂養(yǎng)小鼠，造模時(shí)間為16周，血清結(jié)果顯示，該小鼠血清骨吸收指標(biāo)CTX-I水平明顯增高，骨形成指標(biāo)PINP水平明顯降低，這與骨形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果變化具有一致性，因?yàn)槠淦乒羌?xì)胞數(shù)目增多，成骨細(xì)胞數(shù)目減少，骨形成率下降，提示了該高脂飼料造成小鼠出現(xiàn)高脂血癥，因此這可能導(dǎo)致小鼠的骨形成下降和骨吸收增強(qiáng)。與此同時(shí)，有研究[8]報(bào)道也出現(xiàn)一致的結(jié)果，高脂飼料會(huì)造成小鼠成骨細(xì)胞功能下降和破骨細(xì)胞功能活躍，其原因需要進(jìn)一步探討。

有研究[8]報(bào)道，同樣采用含有60%脂肪的高脂飼料喂養(yǎng)小鼠，其喂養(yǎng)時(shí)間為8周，雖然小鼠骨密度均降低，但是其骨微結(jié)構(gòu)變化與本研究的結(jié)果不一致，本研究Micro-CT結(jié)果顯示，HFD組小鼠骨微結(jié)構(gòu)明顯受到破壞，這可能與喂養(yǎng)時(shí)間不同有密切關(guān)系，這提示長(zhǎng)期給予高脂飼料，不但造成高脂血癥，而且會(huì)逐漸影響骨微結(jié)構(gòu)。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，HFD組小鼠的骨生物力學(xué)性能明顯下降，提示高脂血癥導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降。

積雪草酸作為常用中藥，在降血脂和抗氧化方面具有顯著效果，最近，也有研究發(fā)現(xiàn)積雪草酸具有抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化功能。所以，從這一角度出發(fā)，本文通過(guò)觀察了不同劑量積雪草酸對(duì)血脂、骨轉(zhuǎn)換代謝、抗氧化指標(biāo)、骨密度和骨微結(jié)構(gòu)的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)高脂血癥小鼠骨量丟失的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀可明顯下降高脂血癥小鼠TC水平，高劑量積雪草酸和辛伐他汀對(duì)小鼠高脂血癥的治療效果相當(dāng)，但是低劑量積雪草酸并未發(fā)揮降血脂的作用，這說(shuō)明積雪草酸在適當(dāng)劑量范圍下具有明顯的降血脂能力，與給藥濃度呈一定的正相關(guān)。在高脂血癥病理狀態(tài)下，HFD組小鼠抗氧化機(jī)制受到破壞，這與Xiao等[21]的研究結(jié)果具有一致性，即是高脂血癥會(huì)造成機(jī)體抗氧化能力降低。除了低劑量的積雪草酸之外，中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀治療組的小鼠SOD水平明顯升高，MDA水平明顯下降，這提示中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀治療組抗氧化能力得到顯著改善。原因可能是中劑量和高劑量的積雪草酸具有降血脂作用，并且具有對(duì)抗脂質(zhì)氧化的能力[22]，這會(huì)提升機(jī)體抗氧化的能力，從而在減緩高血脂導(dǎo)致骨組織受損程度，因此起到保護(hù)骨組織的重要作用。

本文的骨密度、骨微結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)結(jié)果顯示，中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀對(duì)高血脂導(dǎo)致的骨量丟失和骨結(jié)構(gòu)受損有明顯的保護(hù)作用，并且提高骨強(qiáng)度，但是低劑量積雪草酸并未發(fā)揮該作用，這主要由于中劑量和高劑量的積雪草酸治療組能明顯促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收，因?yàn)檠汗寝D(zhuǎn)換代謝指標(biāo)和骨形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果可以解釋以上結(jié)論，也有可能中劑量和高劑量的積雪草酸和辛伐他汀可以抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)其成骨細(xì)胞分化[7]，并且也與中劑量和高劑量的積雪草酸具有提升機(jī)體抗氧化的能力有密切的聯(lián)系。除低劑量積雪草酸之外，中劑量和高劑量的積雪草酸具有抗骨量丟失的作用，且高劑量積雪草酸效果稍優(yōu)于中劑量，這提示積雪草酸在適當(dāng)劑量范圍下能促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收，高劑量積雪草酸組未見(jiàn)不良反應(yīng)，因此，關(guān)于積雪草酸在保護(hù)高血脂小鼠骨量丟失的最佳的藥物劑量需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂和氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)造成或加重機(jī)體骨量丟失。本研究表明適當(dāng)劑量的積雪草酸具有保護(hù)骨量丟失作用，其作用產(chǎn)生主要是促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收，也可能與積雪草酸能通過(guò)對(duì)抗脂質(zhì)氧化來(lái)抑制機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和成骨細(xì)胞分化，緩解骨量丟失。另外，也可能與積雪草酸降低血脂，從而抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)其成骨細(xì)胞分化，防止骨量丟失。