3T3-E1細胞增殖分化過程中雷洛昔芬對內質網應激的影響

宋利娜 徐麗麗 羅歡 楊乃龍

青島大學附屬醫(yī)院內分泌科，青島 266000

絕經后骨質疏松(postmenstrual osteoporosis，PMOP)是由于女性絕經后雌激素水平下降導致的以骨量減少、骨微結構破壞為特征的骨形成與骨吸收失衡的代謝性骨病，因此雌激素與雌激素受體調節(jié)劑[雷洛昔芬(raloxifene，RXL)]均可用于絕經后骨質疏松癥的治療。近年來，內質網應激(endooplasmic stress，ER)對骨質疏松的研究得到廣泛關注，有學者認為ER在細胞的增殖分化、分泌、凋亡過程中均發(fā)揮著重要作用[1-2]。雷洛昔芬是否通過此途徑影響成骨細胞的增殖及分化尚未見報道。本實驗將雷洛昔芬(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L)作用于3T3-E1細胞，觀察它們對細胞增殖及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活力的影響，同時應用qRT-PCR的方法觀察IRE-1、ATF6及eIF2α的表達情況，研究內質網應激通路是否參與SERM對成骨細胞增殖及分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-E1細胞購自上海中科院細胞庫，雷洛昔芬購自美國Santa公司，α-DMEM、胎牛血清、雙抗(美國GIBCO公司)，DMSO(美國Sigma公司)，CCK8試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，TRIZOL(美國Gibco公司)，反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(美國Tiangen公司)，引物由上海生物工程技術服務公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：3T3-E1細胞內加入10%胎牛血清和1%雙抗的α-DMEM培養(yǎng)液5 mL，調整細胞密度，接種于合適培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次，待細胞增長至80%左右時，取細胞進行實驗。

1.2.2CCK8法測定細胞增殖：3T3-E1細胞懸液以1×105/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h使細胞貼壁。加入終濃度為10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L的雷洛昔芬培養(yǎng)液及僅加培養(yǎng)液的對照組。每組設5個復孔，另設調零孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h檢測吸光度，終止反應。每孔加入10 μL的CCK8溶劑，繼續(xù)孵育4 h，在酶標儀450 nm波長處測定各孔的吸光度值[D(450)]。

1.2.3ALP活力測定：將細胞消化、離心、重懸，以細胞數(shù)1×105/孔接種于96孔板，分組同上，放置37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，每組設3個復孔，另設酚標準孔。具體步驟如下：5 μL細胞培養(yǎng)上清液，緩沖液和基質液各50 μL，充分混勻，37 ℃水溶15 min，加顯色劑150 μL，輕輕振搖孔板混勻，于酶標儀520 nm波長下測定各孔的吸光度值(OD值)并記錄結果。

培養(yǎng)細胞中ALP活力(金氏單位/gprot)=[(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)]×標準品濃度(0.02 mg/mL)/待測樣本蛋白濃度(gprot/mL)

1.2.4qRT-PCR檢測IRE-1、ATF6及eIF2α的表達：3T3-E1細胞接種于6孔板，37 ℃、5%CO2條件下過夜培養(yǎng)后加入10-7mol/L雷洛昔芬，于24 h后收集細胞，用Trizol提取細胞樣本中總RNA，取1μg總RNA逆轉錄合成cDNA，然后用RealTime-PCR試劑盒對目的基因進行定量檢測，分別取1 μL cDNA，上游和下游引物各0.6 μL，2×Premix 10 μL，反應體系20 μL。反應條件：95℃15 min，95℃15 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。PCR擴增IRE-1、ATF6及eIF2α(表1)，以β-actin為內參，采用計算2-ΔΔCT的定量方法分析數(shù)據(jù)。

表1 基因序列及其引物Table 1 Gene sequences and primers

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 3T3E-1細胞形態(tài)

3T3E-1細胞貼壁生長，呈長梭形、三角形或多角形等不規(guī)則形，細胞之間通過長短不一的樹突相互連接(圖1)。

圖1 3T3E-1細胞形態(tài)(40×)Fig.1 3T3 E-1 cells Morphology (40×)

2.2 雷洛昔芬對3T3-E1細胞增殖的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，對照組、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L組的OD值分別為0.434±0.029、0.475±0.016、0.539±0.009、0.637±0.018(圖2)。3T3-E1細胞增殖測定與對照組相比，實驗各組OD值均顯著增高(P<0.05)，且隨著雷洛昔芬濃度的升高，測定OD值逐漸增高，各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 不同濃度雷洛昔芬對3T3-E1細胞增殖的影響(與對照組比較，aP<0.05)Fig.2 Effects of different concentrations of raloxifene on the proliferation of 3T3-E1 cells(Comparison with control group，aP<0.05)

2.3 雷洛昔芬對3T3-E1細胞成骨分化的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，對照組、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L組的ALP活力值依次為 0.016±0.002、0.031±0.002、0.052±0.004、0.062±0.007(圖3)，與對照組相比，實驗組各組ALP活力均增高(P<0.05)，且高濃度雷洛昔芬促進成骨活性的能力高于其他濃度組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 不同濃度雷洛昔芬對3T3-E1細胞ALP活力的影響(與對照組比較，aP<0.05)Fig.3 Effects of different concentrations of raloxifene on alkaline phosphatase activities of 3T3-E1 cells(Comparison with control group，aP<0.05)

2.4 qRT-PCR檢測IRE-1、ATF6及eIF2α的表達水平

實驗發(fā)現(xiàn)，對照組細胞24 h eIF2α、ATF6及IRE-1mRNA的相對表達水平為1。10-7mol/L RXL組細胞24 h eIF2α、ATF6及IRE-1mRNA的相對表達水平分別為3.723±0.313、3.619±0.239、4.582±0.875(圖4)，雷洛昔芬組IRE-1、ATF6及eIF2αmRNA的表達水平均較對照組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 10-7 mol/L雷洛昔芬對ERS的影響(與對照組比較，aP<0.05)Fig.4 Effect of 10-7 mol/L raloxifene on endoplasmic reticulum stress (ERS)(Comparison with control group，aP<0.05)

3 討論

雷洛昔芬是第2代人工合成的非類固醇類苯噻吩化合物，是第1個被批準用于預防和治療絕經后骨質疏松的選擇性雌激素受體調節(jié)劑[3]，具有組織特異性，對體內某些組織(如骨組織)具有雌激素作用，而對另外一些組織(如乳腺、子宮內膜)表現(xiàn)為抗雌激素作用[4]。與雌激素替代療法相比較，它不增加子宮內膜的厚度，不引起陰道出血，可顯著降低浸潤性乳腺癌的危險性，并且對血脂代謝有良好的作用，因此成為臨床上防治PMOP的理想選擇。

雷洛昔芬能有效治療絕經后婦女的骨質疏松癥。RXL不僅可促進成骨細胞的增殖及分化，從而調節(jié)骨形成及骨重建，并且可抑制破骨細胞的活性，從而抑制骨吸收[5]。Curiel等[6]研究發(fā)現(xiàn)RLX可降低去卵巢骨質疏松模型的高轉換狀態(tài)，減少脛骨、股骨及腰椎松質骨小梁的重吸收及骨量丟失。研究表明，雷洛昔芬的作用在10-9mol/L～10-7mol/L濃度范圍內呈劑量相關性，隨濃度的增加對成骨細胞的刺激作用增加，因此本實驗應用10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L雷洛昔芬作用于3T3-E1細胞，結果顯示CCK8及ALP均升高，亦隨雷洛昔芬濃度的增加CCK8及ALP活力升高，表明雷洛昔芬可促進體外培養(yǎng)的3T3-E1細胞的增殖及分化，與以往的研究結果相一致。

內質網是細胞內最大的細胞器，是蛋白質及脂質合成、折疊、翻譯后修飾，細胞的應激反應，細胞鈣水平等活動的重要場所[7-8]。內質網內未折疊或錯誤折疊蛋白集聚和膜內外鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，內質網失去正常的生理功能從而引發(fā)細胞一系列適應性調節(jié)過程，稱為內質網應激[9](endoplasmic reticulum stress，ERS)。內質網通過激活胞內信號轉導來反應腔內未折疊蛋白的壓力，稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，UPR是細胞的保護性反應，內質網穩(wěn)態(tài)是否能夠恢復，取決于刺激的強度和持續(xù)的時間。

現(xiàn)有的研究表明，內質網應激導致的細胞信號轉導主要包括以下3條通路：PERK(protein kinase R-liae ER kinase)通路、ATF6(activating transcription factor 6)通路、IRE1(inositol-requiring enzyme 1)通路。內質網應激的過程與免疫球蛋白BiP(immunoglobulin binding protein，or glucose regulating protein78，又稱為GRP78)的游離密切相關。在內質網穩(wěn)態(tài)的情況下，GRP78與上述3個蛋白結合，而內質網內環(huán)境紊亂時導致Bip與PERK、ATF6及IRE1解離，而與GRP78解離后的3個蛋白分別被激活，啟動內質網應激的信號轉導通路，對細胞進行保護作用[10]。輕度的內質網應激能夠激發(fā)成骨細胞的功能，從而促進骨組織的形成。Hamamura等[11]發(fā)現(xiàn)，機體處于應激時可通過調節(jié)ATF4/CHOP通路影響成骨細胞的分泌及分化功能。目前研究顯示，PERK路徑能夠通過上調eIF-2α的磷酸化水平激活成骨細胞活性，最終增加骨形成并抑制破骨細胞形成以減少骨破壞[12-13]。在低水平的ERS下，ATF4的表達在成骨細胞中升高，同時骨形成因子Runx2等的表達也升高，從而促進骨形成，有效緩解骨質疏松的進展[14]，XBP1能夠直接捆綁RUNX2蛋白從而促進骨形成。目前已經發(fā)現(xiàn)胍那芐是通過ERS介導的信號通路治療骨質疏松的藥物，并發(fā)現(xiàn)對緩解骨質疏松有一定效果[15]。有研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞的增殖能夠通過IRE1信號通路實現(xiàn)，同時能促進成骨細胞分泌膠原蛋白及骨鈣素。同時有研究表明，高濃度的蛇床子素能促進ALP蛋白的表達，而過多的ALP蛋白能夠在內質網中聚集，超過ER處理范圍時引發(fā)ERS，而蛇床子素具有性激素樣作用。綜上所述，ERS與成骨細胞的增殖及分化有密切關系，因此本實驗在刺激內質網相關基因表達時，選用了較高濃度10-7mol/L的雷洛昔芬，實驗結果發(fā)現(xiàn)，內質網相關的IRE-1、ATF6及eIF2αmRNA水平均有所升高，提示內質網應激可能參與了成骨細胞的增殖及分化。

絕經后骨質疏松癥常發(fā)生在絕經后5～10年，主要與體內雌激素下降有關，臨床表現(xiàn)為骨痛、骨骼畸形，嚴重者可發(fā)生骨折，使生活質量下降增加死亡率及病殘率，它已成為一種嚴重的社會公共健康問題。雷洛昔芬作為一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑，與雌激素相比，能夠減少子宮內膜癌及乳腺癌的危險性，因此為絕經后骨質疏松癥患者提供了又一選擇。隨著雷洛昔芬在臨床上逐漸被應用，其作用機制也逐漸得到深入研究，因成骨細胞的增殖、分化、成熟的過程是一個復雜而精密的調節(jié)過程，涉及多個骨生成相關的信號通路，而內質網應激相關通路參與其中及是否有其他機制參與，仍有待進一步研究。