長(zhǎng)春市漢族女性維生素D受體基因BsmⅠ和FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與骨密度相關(guān)性研究

馬倩倩 毛未賢 高遠(yuǎn) 宋世凱 尹紀(jì)偉 張萌萌

吉林省骨質(zhì)疏松診療中心(吉林大學(xué)第四醫(yī)院)，長(zhǎng)春 130011

維生素D是維持正常骨代謝的重要調(diào)節(jié)因子，維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)是介導(dǎo)1,25-(OH)2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，屬于類(lèi)固醇/甲狀腺激素受體超家族成員[1]。自1994年Morrison等[2]首次揭示VDR基因多態(tài)性與骨密度(bone mineral density，BMD)有關(guān)聯(lián)以來(lái)，VDR基因已成為國(guó)內(nèi)外研究最廣泛的與骨代謝相關(guān)的基因之一。VDR基因多態(tài)性分別對(duì)應(yīng)多個(gè)酶切位點(diǎn)，其中研究較深入的有BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ4個(gè)位點(diǎn)，但是不同種族、不同地區(qū)研究結(jié)果不盡相同[3]。本文研究長(zhǎng)春市230例35～85歲漢族女性BsmⅠ、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性及其BMD的相關(guān)關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取我院體檢和住院的長(zhǎng)春市230例35～85歲漢族女性，平均年齡(58.5±12.2)歲。在長(zhǎng)春市長(zhǎng)期居住10年以上且相互無(wú)血緣關(guān)系，排除急、慢性肝、腎疾病、糖尿病、高血壓、甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀旁腺機(jī)能減退、甲亢、甲減、腫瘤及放化療患者。記錄受試者一般情況，按照絕經(jīng)情況分為絕經(jīng)組142例[(64.9±8.1)歲]和未絕經(jīng)組88例[(45.3±5.8)歲]。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

德國(guó)Eppendorf Mastercycler pro梯度PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)Biorad 164-5052電泳儀，美國(guó)SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)，Hologic Discovery WA型骨密度儀。

1.3 方法

1.3.1提取基因組DNA：抽取230例受試者外周靜脈血3 mL，采用磁珠法DNA提取試劑盒(長(zhǎng)春志昂生物科技)，嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.2引物設(shè)計(jì)與合成：BsmⅠ位點(diǎn)：上游引物5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3′，下游引物5′-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3′；FokⅠ位點(diǎn)：上游引物5′-AGCTGGCCCTGGCACTGAC TCTGCTCT-3′，下游引物5′-ATGGAAACACCTT GCTTCTTCTCCCTC-3′(吉林省庫(kù)美生物合成)。

1.3.3PCR：提取的DNA模板4.5 μL，10 μM上下游引物各1.5 μL，2×Taq PCR Mix 15 μL(康潤(rùn)生物)，去離子水7.5 μL補(bǔ)至30 μL反應(yīng)體系。94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。

1.3.4限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析：取PCR產(chǎn)物10 μL，加入BsmⅠ/FokⅠ快速內(nèi)切酶(美國(guó)Thermo Fisher)1 μL，10×FastDigest Buffer 2 μL，去離子水17 μL補(bǔ)至30 μL反應(yīng)體系，37 ℃水浴5 min進(jìn)行酶切，65 ℃水浴5 min終止反應(yīng)。2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀(guān)察條帶，650 bp和175 bp兩條帶為bb型，825 bp一條帶為BB型，825 bp、650 bp和175 bp 3條帶為Bb型；265 bp一條帶為FF型，196 bp和69 bp兩條帶為ff型，265 bp、196 bp和69 bp 3條帶為Ff型。

1.3.5采用Hologic Discovery WA型骨密度儀檢測(cè)腰椎正位(L1～4)BMD，每次開(kāi)機(jī)后均用模體校正，測(cè)量誤差小于0.5%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基因型頻率分布采用χ2檢驗(yàn)，各基因型BMD分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在本研究人群中，BsmⅠ位點(diǎn)基因型以bb型為主，占83.9%，BB型只發(fā)現(xiàn)8例，占3.5%，Bb型占12.6%，b等位基因頻率高達(dá)90.2%，B等位基因頻率為9.8%；FokⅠ位點(diǎn)基因型ff、Ff和 FF分別占18.3%、43.9%和37.8%，f等位基因頻率為40.2%，F(xiàn)頻率為59.8%，兩位點(diǎn)基因分布均符合Hardy-Weinberg定律(χ2=1.283，P=0.125；χ2=0.96，P=0.342)；未絕經(jīng)組與絕經(jīng)組各基因型分布組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BsmⅠ位點(diǎn)在未絕經(jīng)組和絕經(jīng)組中各基因型BMD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；FokⅠ位點(diǎn)ff型BMD較FF型和Ff型低，但在未絕經(jīng)組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，絕經(jīng)組中ff型與FF型比較，BMD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

230例受試者BsmⅠ和FokⅠ酶切位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布見(jiàn)表1，未絕經(jīng)組與絕經(jīng)組BsmⅠ、FokⅠ位點(diǎn)基因型分布見(jiàn)表2、3，BsmⅠ和FokⅠ兩個(gè)位點(diǎn)各基因型腰椎(L1～4)骨密度值見(jiàn)表4。

表1 BsmⅠ和FokⅠ位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布Table 1 BsmⅠand FokⅠgenotype and allele frequency distribution

表2 未絕經(jīng)組與絕經(jīng)組BsmⅠ位點(diǎn)基因型分布Table 2 BsmⅠgenotype distribution in premenopausal group and postmenopausal group

表3 未絕經(jīng)組與絕經(jīng)組FokⅠ位點(diǎn)基因型分布Table 3 FokⅠgenotype distribution in premenopausal group and postmenopausal group

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是遺傳和環(huán)境因素共同參與的多因子復(fù)雜疾病，VDR基因是目前研究最廣泛的與骨代謝相關(guān)的基因之一[4]。VDR等位基因多態(tài)性與骨密度、骨轉(zhuǎn)換、腸道鈣吸收存在一定關(guān)聯(lián)，能特異地結(jié)合1，25(OH)2D3并作用于靶細(xì)胞核，發(fā)揮調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化、增生的生物學(xué)作用，從而影響骨鈣化、骨骺生長(zhǎng)[5]。受性別、年齡、民族、受試人種、樣本量、環(huán)境影響等多種因素影響，目前VDR基因BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ等位點(diǎn)多態(tài)性與骨質(zhì)疏松的研究結(jié)論沒(méi)有一致的結(jié)果[3]。

在BsmI酶切位點(diǎn)，Saadi等[6]報(bào)道了我國(guó)人群B等位基因頻率不到10%。王秀玲等[7]研究顯示，哈爾濱地區(qū)部分漢族人群b等位基因出現(xiàn)的頻率為91.8%，B等位基因出現(xiàn)的頻率為8.2%，BB型占0%，Bb型占16.3%，bb型占83.7%。在本研究人群中，BsmⅠ位點(diǎn)基因型以bb型為主，占83.9%，BB型占3.5%，Bb型占12.6%，b等位基因頻率高達(dá)90.2%，B等位基因頻率為9.8%，與Saadi等[6]、王秀玲等[7]的研究結(jié)果基本一致。與Zhang等[8]對(duì)中國(guó)漢族絕經(jīng)婦女研究結(jié)果接近(bb、Bb、BB基因型分布分別為90.5%、9.5%、0%)，與朝鮮族絕經(jīng)期婦女的研究結(jié)果不一致(bb、Bb、BB基因型分布分別為38.1%、55.56%和6.35%)。與韓國(guó)人相似(11%左右)，略低于日本人(15%～20%)[9]。而與美國(guó)及其他西方國(guó)家的研究結(jié)果不同，美國(guó)、澳大利亞以Bb基因型最多[10]。提示種族不同，導(dǎo)致VDR基因多態(tài)性的差異。

表4 BsmⅠ和FokⅠ兩個(gè)位點(diǎn)各基因型腰椎(L1～4)骨密度值比較(g/cm2)Table 4 Spine lumbar (L1-4) BMD value of each genotype of BsmⅠand FokⅠ(g/cm2)

注：*表示ff基因型骨密度值與FF型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他各基因型骨密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

本研究結(jié)果顯示BsmⅠ位點(diǎn)各基因型BMD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與繆應(yīng)新等[11]對(duì)611名上海地區(qū)漢族人VDR基因型與BMD關(guān)系的研究結(jié)果一致，認(rèn)為VDR基因型和BMD無(wú)關(guān)聯(lián)。吳文等[12-13]對(duì)廣州地區(qū)絕經(jīng)后婦女VDR基因多態(tài)性與BMD關(guān)系的研究結(jié)果顯示，bb與Bb、BB基因型在腰椎BMD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而對(duì)絕經(jīng)前婦女的研究結(jié)果顯示各基因型與BMD無(wú)關(guān)。

FokI多態(tài)性位點(diǎn)位于VDR基因第2外顯子的起始區(qū)，是目前所了解的VDR基因多態(tài)性中惟一個(gè)改變氨基酸序列長(zhǎng)度的位點(diǎn)。VDR基因中FokI位點(diǎn)基因型以Ff為主[5]。在本研究結(jié)果中，F(xiàn)f型占 43.9%，ff和FF分別占18.3%、37.8%。與韓昕等[14]對(duì)北京地區(qū)230名健康漢族男性FokⅠ多態(tài)性研究結(jié)果基本一致(FF占36.96%，F(xiàn)f占46.96%，ff占16.08%)。與Morita等[15]所報(bào)道的日本女性結(jié)果接近(FF占38.7%，F(xiàn)f占47.7%，ff占13.6%)。

本研究顯示，F(xiàn)okⅠ位點(diǎn)ff型BMD較FF型和Ff型低，但在未絕經(jīng)組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，絕經(jīng)組中ff型與FF型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與韓昕等[14]對(duì)北京地區(qū)漢族男性FokⅠ多態(tài)性位點(diǎn)與BMD關(guān)系的研究結(jié)果相似，該研究顯示40～59歲年齡段男性ff基因型腰椎L2～4BMD較FF型低(P=0.001)。Yasovanthi等[16]研究也顯示FokⅠ基因多態(tài)性與低骨量有關(guān)。Kalak等[17]在波蘭西部地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)該地區(qū)人群腰椎BMD ff(0.792 g/cm2)

綜上所述，本研究顯示VDR基因多態(tài)性與性別、年齡、民族、樣本量、環(huán)境影響等多種因素相關(guān)，目前對(duì)女性VDR基因多態(tài)性與BMD的研究較多，但兒童和男性的研究較少，因此仍需開(kāi)展更多高質(zhì)量大樣本的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究工作仍在進(jìn)行中，以后將進(jìn)一步增加男性受試者和總的樣本量，以期更好地評(píng)價(jià)VDR基因多態(tài)性對(duì)骨質(zhì)疏松的影響。