北京港口水產(chǎn)品中非O1/O139群霍亂弧菌MLST分型研究

付溥博， 張 琳， 曾 靜， 張西萌， 魏詠新， 魏海燕， 耿 榮

(1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局， 北京 朝陽(yáng) 100026 ； 2.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局， 河北 石家莊 050051)

霍亂弧菌為革蘭陰性菌，是人類霍亂病的病原體。根據(jù)霍亂弧菌O抗原的不同，可分為210多種血清型，過(guò)去O1和O139型被認(rèn)為是引起霍亂流行的主要血清型[1]，所以在檢驗(yàn)霍亂弧菌時(shí)，常常檢驗(yàn)此2種血清型，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)非O1/O139群霍亂弧菌也會(huì)導(dǎo)致疾病[2]。非O1/O139群霍亂弧菌是指除O1群霍亂弧菌和O139群霍亂弧菌以外的霍亂弧菌[3]，是一種全世界都有分布的水生性細(xì)菌，廣泛存在于自然界的水體中，常常在水體或水產(chǎn)品中檢出。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，散發(fā)或局部暴發(fā)的腹瀉是由非O1/O139群霍亂弧菌引起的，此類菌群引起了細(xì)菌學(xué)家們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[4]。

多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)起源于多位點(diǎn)酶凝膠電泳(Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE)[5]，是一種針對(duì)微生物群體中緩慢基因位點(diǎn)變異進(jìn)行分型的方法。此方法較簡(jiǎn)單快速，有著較高的分辨率，最主要是其可以通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)的共享與比較，并利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保留，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可與多年前的數(shù)據(jù)相比較[6]。此方法正逐漸被認(rèn)作沙門、耶爾森等細(xì)菌分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]，有部分學(xué)者認(rèn)為此方法是進(jìn)行流行病學(xué)研究最為可靠的工具[8-9],其結(jié)果比脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)方法有著更好的分辨率[10]。本研究采用現(xiàn)有的MLST標(biāo)準(zhǔn)程序，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的67株分離自進(jìn)出口水產(chǎn)品中的霍亂弧菌進(jìn)行分析，并匯總MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中菌株信息，進(jìn)行了基因分型和系統(tǒng)進(jìn)化的分析。

1 材料與方法

1.1 材料 67株霍亂弧菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的分離自2007-2011年北京港口進(jìn)出口水產(chǎn)品中的菌株。所有菌株活化后，經(jīng)VITEK 2 Compact鑒定符合霍亂弧菌的生化特征，經(jīng)血清試驗(yàn)驗(yàn)證均為非O1非O139血清型。菌株來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 菌株來(lái)源與ST型

1.2 儀器與試劑 PCR儀(美國(guó)羅克韋爾自動(dòng)化公司)；水平式核酸電泳儀和凝膠成像分析儀(美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)。

堿性蛋白胨水(Alkaline Peptone Water ,APW)(北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司，161207)；熒光PCR用引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(20161018)；7對(duì)管家基因引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成(20170108)；TaqDNA聚合酶PCR試劑盒(普洛麥格生物技術(shù)有限公司，20170517)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取 將保存菌株在APW中培養(yǎng)過(guò)夜，取菌懸液1 mL于Eppendorf管中，10 000 r/min離心2 min，棄去上清，加50 μL無(wú)菌水，煮沸裂解10 min，冰浴5 min，10 000 r/min離心2 min，上清液即為DNA模板。立即用于PCR擴(kuò)增或短期保存于-20 ℃。

1.3.2 致病基因的檢測(cè) 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)菌株的CTX、toxR和hlyA基因，其20 μL體系為：10 μL 2 ×TaqMan Universal Master Mix，目標(biāo)菌上游引物、下游引物(10 μmol/L)各1 μL:，探針(10 μmol/L)1 μL，模板50 ng ～100 ng，用滅過(guò)菌的雙蒸水補(bǔ)足20 μL。引物探針具體序列見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)條件：50 ℃，2 min； 95 ℃，10 min；95 ℃，15 s； 60 ℃,60 s；40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μL。具

表2 致病基因檢測(cè)用引物探針

1.3.3 MLST目標(biāo)基因的選擇和引物的設(shè)計(jì) 選擇霍亂弧菌的adk、gyrB、metE、mdh、pntA、pyrC、purM7對(duì)管家基因作為MLST分析基因。PCR 擴(kuò)增和測(cè)序引物引用http://pubmlst.org/vcholerae/info/primers.pdf 網(wǎng)站上發(fā)表的PCR引物序列。

1.3.4 PCR 擴(kuò)增體系與條件 PCR反應(yīng)50 μL體系包括：雙蒸水38 μL，TaqDNA Polymerase(5 U/μL)1μL，PremixExTaqTM(10×, 含Mg2+) 5 μL,dNTP 1 μL,上游引物、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，模板DNA 3 μL。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性10 min；96 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，70 ℃延伸1 min，30次循環(huán)后70 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在加入溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠上電泳，后在成像儀的紫外光下觀察擴(kuò)增效果。

1.3.5 管家基因的測(cè)序及序列分析 將條帶單一且位置正確的PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)得序列與NCBI上查詢到的7種管家基因的進(jìn)行比較，應(yīng)用軟件DNAStar-MegAlign7.0將測(cè)得的序列裁剪到合適的大小。將裁剪好的序列按adk-gyrB-mdh-metE-pntA-purM-pyrC的順序進(jìn)行拼接，應(yīng)用軟件DNAStar-SeqMan 7.0 連接為3 215 bp的片段。將所得片段提交至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲取等位基因譜(Allele profile)和序列型(Sequence types，STs)。若發(fā)現(xiàn)新的等位基因及ST，則將新的信息上報(bào)至管理員，以獲得等位基因號(hào)碼和ST號(hào)碼。應(yīng)用eBURSTv3.0軟件對(duì)我實(shí)驗(yàn)室分離菌株的STs和pubmlst上的數(shù)據(jù)，進(jìn)行克隆群(Clonal Complex，CC)、組(Groups)和單體(singletons)分析；并應(yīng)用goeBURST軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 致病基因CTX、toxR、hlyA檢測(cè)結(jié)果 67株菌株針對(duì)CTX、toxR、hlyA3種毒力基因擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

2.2 管家基因擴(kuò)增結(jié)果 所有菌株均擴(kuò)增出7個(gè)管家基因位點(diǎn)的目的片段結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸濃度及純度均符合測(cè)序要求。

2.3 霍亂弧菌MLST分型結(jié)果 將等位基因譜提交至MLST網(wǎng)站,結(jié)果顯示，67株霍亂弧菌可分為62個(gè)STs。其中原有STs 2個(gè)，新發(fā)現(xiàn)STs 60個(gè)。其中相同的ST型有ST377 2株，均來(lái)源于中國(guó)；ST380 3株，均來(lái)源于中國(guó)；ST383 2株，均來(lái)源于泰國(guó)；ST388 2株，均來(lái)源于中國(guó)。原有ST型為ST271、ST338；新發(fā)現(xiàn)STs經(jīng)MLST網(wǎng)站管理員確認(rèn)編號(hào)為ST369～ST428。

2.4 本試驗(yàn)結(jié)果與pubmlst數(shù)據(jù)庫(kù)相比較的eBURST分析結(jié)果 由于本試驗(yàn)用菌株均為非產(chǎn)毒株，基因變異性較大，分布分散(圖1)。用Seqman軟件分別對(duì)這些菌株的7對(duì)管家基因進(jìn)行分析，其基因相似度分別為90.4%～100%(adk)、91.8%～100%(gyrB)、88.6%～100%(mdh)、94.0%～100%(metE)、96.6%～100%(pntA)、41.9%～100%(purM)、86.5%～100%(pyrC)，用Mega 7.0 分別對(duì)這7對(duì)管家基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，用Neighbor-Joining(NJ)法繪制進(jìn)化樹，其中adk、gyrB、mdh、metE、pntA、pyrC基因相似度較接近，結(jié)果以adk可以為例見(jiàn)圖2，purM基因差異最大，結(jié)果見(jiàn)圖3。以上結(jié)果說(shuō)明這些菌株的管家基因，尤其是purM基因發(fā)生了較大的遺傳變異。繼續(xù)將pubmlst數(shù)據(jù)庫(kù)中全部霍亂弧菌的STs進(jìn)行分析，截止到2017年2月，數(shù)據(jù)庫(kù)中霍亂弧菌共有STs 505個(gè)，做eBURST分析，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)可歸為7個(gè)組別(圖4)。其中明顯成克隆群的CC71-75、CC176-173、CC430，根據(jù)Pubmlst數(shù)據(jù)庫(kù)中信息可知，均為產(chǎn)毒株。根據(jù)上面數(shù)據(jù)分組情況，將Pubmlst數(shù)據(jù)庫(kù)中(包括本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))與本實(shí)驗(yàn)相關(guān)的數(shù)據(jù)做goeBURST分析，共將71個(gè)STs歸為7個(gè)組別(圖5)，其中方形框?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室結(jié)果具體結(jié)果為ST-88～ST-8～ST-384，其中菌株來(lái)源于中國(guó)和澳洲，本試驗(yàn)結(jié)果為ST-384，來(lái)源于中國(guó)；ST-423～ST-204～ST-294，其中菌株來(lái)源于泰國(guó)和法國(guó)，本試驗(yàn)結(jié)果為ST-423來(lái)源于泰國(guó)；ST-403～ST-267，其中菌株均來(lái)源于中國(guó)，本試驗(yàn)結(jié)果為ST-403，來(lái)源于中國(guó)；ST-411～ST-15，其中菌株來(lái)源于中國(guó)和澳洲，本試驗(yàn)結(jié)果為ST-411，來(lái)源于中國(guó)；ST-416～ST-205，其中菌株來(lái)源于中國(guó)和泰國(guó)，本試驗(yàn)結(jié)果為ST-416，來(lái)源于中國(guó)；ST-338～ST-348，其中菌株來(lái)源于中國(guó)和非洲，本試驗(yàn)結(jié)果為ST-338，來(lái)源于中國(guó)；ST-385～ST-326，其中菌株來(lái)源于中國(guó)和法國(guó)，本試驗(yàn)結(jié)果為ST-385，來(lái)源于中國(guó)。

圖1本試驗(yàn)STs的eBURST分析結(jié)果

注：每個(gè)圓點(diǎn)代表一個(gè)ST型，上標(biāo)數(shù)字即為其具體的ST型

圖2adk基因的NJ進(jìn)化樹

圖3purM基因的NJ進(jìn)化樹

圖4Pubmlst數(shù)據(jù)庫(kù)中STs的eBURST分析結(jié)果

圖5Pubmlst數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)STsgoeBURST分析結(jié)果

3 討論

早期研究認(rèn)為，霍亂弧菌的致病基因主要為CTX基因，但也有毒力基因陰性卻引發(fā)腹瀉暴發(fā)的病例[11]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，散發(fā)或局部暴發(fā)的腹瀉是由非O1/O139群霍亂弧菌引起的，此類菌群引起了科研人員越來(lái)越多的關(guān)注[4]，研究人員發(fā)現(xiàn)，非O1/O139群霍亂弧菌相比O1、O139群霍亂弧菌的菌體多糖分泌的變異，使得前者能形成生物膜，從而能更好的抵御不良環(huán)境，更適于在其在水產(chǎn)品中生存與繁殖[12]，而在外界某些條件的作用下非O1/O139群霍亂弧菌會(huì)通過(guò)抗原漂移來(lái)獲得毒力基因[13]。故此只有對(duì)霍亂弧菌的分子分型進(jìn)行深入的研究，才能了解該細(xì)菌的分型特征及進(jìn)化、以及溯源情況，并避免產(chǎn)品間或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)的相互污染。

本試驗(yàn)共從非O1/O139群霍亂弧菌中新發(fā)現(xiàn)了60個(gè)STs，通過(guò)對(duì)結(jié)果應(yīng)用eBURST、Paup4.0和goeBURST軟件進(jìn)行分析可以看出，本試驗(yàn)的菌株沒(méi)有成組，均為單體，將本實(shí)驗(yàn)的ST結(jié)果與Pubmlst數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)的ST一起進(jìn)行MLST分析，本次試驗(yàn)的結(jié)果也并沒(méi)有與數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)成群的ST型，形成7組，這與本實(shí)驗(yàn)室樣品來(lái)源較廣，菌株分離自世界各地的水產(chǎn)品有關(guān)。而且，本試驗(yàn)菌株均為非產(chǎn)毒株，也說(shuō)明環(huán)境非產(chǎn)毒株基因的變化要大于產(chǎn)毒株，此結(jié)論與此前有學(xué)者報(bào)道的“非產(chǎn)毒性霍亂弧菌基因組間差異較大”相符[1]。

應(yīng)用MLST方法對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行研究是較新興的項(xiàng)目，自2013年4月29日開始建立霍亂弧菌的數(shù)據(jù)庫(kù)，迄今此數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)尚不夠完善，對(duì)分組造成了較大影響。在Pubmlst霍亂弧菌數(shù)據(jù)庫(kù)建立之前，有學(xué)者對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行MLST分析時(shí)，選取了與現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)不同的管家基因，據(jù)報(bào)道共涉及了管家基因40個(gè)[14]，從而導(dǎo)致了無(wú)法與很多早些時(shí)候的學(xué)者們研究成果相比較，也說(shuō)明了充分豐富這種全球數(shù)據(jù)庫(kù)的重要性。

從本次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，具有相同ST型的菌株均來(lái)源于相同國(guó)家，這說(shuō)明MLST方法擅長(zhǎng)于顯示不同地理區(qū)域的菌株的進(jìn)化關(guān)系，此方法可以建立一個(gè)可靠的食品污染溯源體系，也說(shuō)明進(jìn)化有一定的地域性；而成組的ST型則來(lái)源于中國(guó)、泰國(guó)、澳洲、非洲和法國(guó)，說(shuō)明不同地理來(lái)源的菌株也可能有著類似的克隆株，說(shuō)明隨著國(guó)際貿(mào)易的日益發(fā)展，不同大洲之間的細(xì)菌正發(fā)生著基因的水平轉(zhuǎn)移。

但在對(duì)Pubmlst數(shù)據(jù)庫(kù)中的霍亂弧菌進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌沒(méi)有像其他致病菌那樣，產(chǎn)不同毒素的菌株或不同血清型會(huì)明顯成不同群。有學(xué)者就曾報(bào)道，由于霍亂弧菌產(chǎn)毒菌株的高度克隆化，使得MLST方法對(duì)其致病血清的分析效果并不理想[15]，這也是今后研究中值得注意并要解決的問(wèn)題。

總之，本試驗(yàn)利用MLST這種操作簡(jiǎn)單、易于保存數(shù)據(jù)，便于比較不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果，擅長(zhǎng)于顯示不同地理區(qū)域的菌株的進(jìn)化關(guān)系分子方法，對(duì)保存的67株霍亂弧菌進(jìn)行了分子特征的分析，發(fā)現(xiàn)了新的ST型，并向Pubmlst數(shù)據(jù)庫(kù)上傳了數(shù)據(jù)，擴(kuò)充了數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的克隆組，主要來(lái)源于不同國(guó)家，有遺傳多樣性；進(jìn)境水產(chǎn)品中分離菌株多為單體，但相同ST型來(lái)源地一致。