基于RNA-seq技術(shù)分析意大利蜜蜂幼蟲腸道響應(yīng)球囊菌脅迫的高表達(dá)基因

熊翠玲， 黃枳腱， 梁 勤， 徐細(xì)建， 張曌楠， 駱 群， 劉 敏， 陳大福， 郭 睿

(1.福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建福州 350002； 2.江西省養(yǎng)蜂研究所，江西南昌 330200)

蜜蜂白堊病是由蜜蜂球囊菌侵染蜜蜂幼蟲而導(dǎo)致的致死性真菌病[1]。該病主要分布在歐洲、北美和中國(guó)等地區(qū)，早在1913年，Maassen等就報(bào)道了白堊病的發(fā)生，我國(guó)大陸1961年也曾報(bào)道發(fā)生類似蜜蜂白堊病的病害[2]。蜜蜂白堊病主要是使老熟幼蟲或封蓋幼蟲死亡，雄蜂幼蟲最易感染，因?yàn)樾鄯溆紫x多在巢脾的邊緣，易受低溫的影響。白堊病會(huì)導(dǎo)致大批幼蟲死亡，造成群勢(shì)下降，嚴(yán)重病群失去產(chǎn)蜂蜜和蜂王漿的能力，嚴(yán)重影響蜂群的生產(chǎn)力。球囊菌屬于球囊菌門球囊菌屬，迄今已鑒定出球囊菌屬的22個(gè)種，它們以致病性真菌或腐生菌存在于蜜蜂體內(nèi)；在蜂群里，患病幼蟲的尸體以及被污染的飼料與巢脾是疾病傳播的主要來(lái)源[3]。國(guó)內(nèi)養(yǎng)蜂生產(chǎn)中使用的主要蜂種是意大利蜜蜂和中華蜜蜂，意蜂極易受到球囊菌的侵染而暴發(fā)白堊病，而中蜂幾乎不受影響。2006年，Evans等公布了西方蜜蜂的基因組，為在分子水平研究西方蜜蜂奠定了基礎(chǔ)[4]。對(duì)于白堊病的前期研究主要是集中在生化[5]、病理[6]及檢測(cè)[7]等方面，分子水平的研究相對(duì)較少。目前，高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于白堊病的研究報(bào)道極少，蜜蜂幼蟲響應(yīng)球囊菌脅迫的應(yīng)答研究仍不深入。

以RNA seq為代表的高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅猛，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于昆蟲包括蜜蜂的相關(guān)研究[8-11]，然而，尚無(wú)利用二代測(cè)序技術(shù)研究白堊病過(guò)程蜜蜂幼蟲應(yīng)答的相關(guān)研究，本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)球囊菌脅迫和正常意蜂幼蟲腸道進(jìn)行深度測(cè)序，對(duì)表達(dá)水平最高的100個(gè)基因進(jìn)行GO分類和KEGG代謝通路富集分析，并比較分析球囊菌侵染幼蟲腸道與正常幼蟲腸道之間高表達(dá)基因的差異。

1 材料與方法

1.1 生物材料

本研究中使用的意大利蜜蜂幼蟲取自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)蜂場(chǎng)，蜜蜂球囊菌菌株由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院蜜蜂保護(hù)實(shí)驗(yàn)室保存并活化。

1.2 主要試驗(yàn)試劑及儀器

RNase-free水購(gòu)自中國(guó)上海生工生物公司，DNaseⅠ和Oligotex mRNA Kits Midi試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，Dynal M280磁珠購(gòu)自Invitrogen公司，高碘酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DNA ligase購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，RNA Reagent抽提試劑盒、ExTaqpolymerase及Superscript Ⅱ reverse transcriptase均購(gòu)自日本TaKaRa公司。純化cDNA的Ampure beads為美國(guó)Agencourt產(chǎn)品，cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒TruSeqTMDNA Sample Prep Kit -Set A為美國(guó)Illumina公司產(chǎn)品。

恒溫恒濕氣候箱購(gòu)自中國(guó)寧波江南儀器廠，超純水儀購(gòu)自中國(guó)四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，倒置顯微鏡為中國(guó)上海光學(xué)儀器五廠產(chǎn)品，超凈工作臺(tái)為中國(guó)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品，PCR儀為美國(guó)Bio Rad公司產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)為中國(guó)上海培清科技有限公司產(chǎn)品，超低溫冰箱為中科美菱低溫科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 意蜂幼蟲飼養(yǎng) 中蜂幼蟲的飼料配方參照王倩等的方法[12]，其中將D-果糖和D-葡萄糖換為新鮮蜂蜜。預(yù)試驗(yàn)中空白對(duì)照組中蜂幼蟲7日齡成活率達(dá)到90%以上，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室建立的中華蜜蜂幼蟲人工飼養(yǎng)模型可為本研究提供符合要求的中蜂幼蟲。從福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院蜂場(chǎng)選擇20群健康蜂群(無(wú)白堊病癥狀且蜜蜂球囊菌特異性引物常規(guī)PCR檢測(cè)為陰性)。用移蟲針挑取2日齡幼蟲，放入無(wú)菌的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔對(duì)應(yīng)1頭幼蟲，孔內(nèi)加有35 ℃預(yù)溫的幼蟲飼料)，將24孔板放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，35 ℃、70% RH條件下培養(yǎng)。每隔24 h吸去舊飼料，加入新飼料。3日齡時(shí)，處理組飼喂含有球囊菌孢子的人工飼料(終濃度為1×107孢子/mL)，空白對(duì)照組飼喂正常人工飼料。適宜條件下飼喂幼蟲至7日齡，處理組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 測(cè)序樣品準(zhǔn)備 腸道組織是球囊菌孢子萌發(fā)的主要場(chǎng)所，也是蜜蜂抵御病原入侵的重要免疫器官，故選擇幼蟲腸道作為測(cè)序材料。分別剖取處理組和對(duì)照組4、5、6日齡幼蟲腸道，為盡量減少腸道RNA的降解，將從解剖取樣到樣品放入液氮速凍的時(shí)間控制在30 s以內(nèi)，每剖取1組樣品，立即液氮速凍并迅速放入-80 ℃超低溫冰箱保存，通過(guò)Illumina Hiseq 2500平臺(tái)對(duì)處理組和對(duì)照組的12個(gè)幼蟲腸道樣品進(jìn)行深度測(cè)序，其中處理組樣品包括4日齡幼蟲腸道(AmT1-1、AmT1-2、AmT1-3)、5日齡幼蟲腸道(AmT2-1、AmT2-2、AmT2-3)和6日齡幼蟲腸道(AmT3-1、AmT3-2、AmT3-3)，對(duì)照組為4日齡幼蟲腸道(AmCK-1、AmCK-2、AmCK-3)。

1.3.3 RNA抽提和cDNA合成 液氮冷卻研磨，按照RNA抽提試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行RNA抽提，最后將RNA溶解于200 μL RNase-free水中。取1 μL溶解的RNA，用Evolution 600分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司，美國(guó))定量確定濃度。

1.3.4 mRNA純化與cDNA合成 抽提的總RNA首先利用10 U DNase Ⅰ在37 ℃條件下消化1 h，然后利用Oligotex mRNA Kits Midi進(jìn)行mRNA純化，純化后的mRNA用分光光度計(jì)進(jìn)行定量。以10 μg mRNA作為模板，GsuI-oligo dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，用1 000 U SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶在42 ℃下孵育1 h合成第1鏈cDNA；隨后利用高碘酸鈉氧化mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)，并連接生物素；通過(guò)Dynal M280磁珠篩選連接了生物素的mRNA/cDNA，并通過(guò)堿裂解釋放第1鏈cDNA；然后通過(guò)DNA連接酶在第1鏈cDNA的5′末端加上接頭，利用ExTaq聚合酶合成第2鏈cDNA。最后通過(guò)GsuⅠ酶切去除polyA和5′端接頭。

1.3.5 cDNA測(cè)序 將3、4、5、6日齡意蜂幼蟲中腸組織的cDNA利用705型Fisher Scientific超聲波破碎儀打斷至 300～500 bp，利用Ampure beads(Illumina公司，美國(guó))進(jìn)行純化。隨后純化的cDNA利用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit -Set A(Illumina公司，美國(guó))構(gòu)建文庫(kù)，并利用TruSeq PE Cluster Kit(Illumina公司，美國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增。最后Illumina Hiseq 2500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，SRA Num：SRA456722。

1.3.6 基因表達(dá)豐度統(tǒng)計(jì) 通過(guò)Illumina PE125測(cè)序，獲得大量原始讀段，去除含接頭、含N比例大于10%的和低質(zhì)量的讀段，得到清晰讀段，進(jìn)而利用Tophat軟件將清晰讀段比對(duì)至意蜂的參考基因組(Amel_4.5)，表達(dá)量的計(jì)算使用FPKM法[10]，其計(jì)算公式為：FPKM=(106C×103)/(NL)。

1.4 高表達(dá)基因的GO分類及KEGG代謝通路富集分析

根據(jù)基因的FPKM值，選取各腸道樣品表達(dá)量水平最高的前100個(gè)基因，利用在線分析工具OmicsShare(http：//www.omicshare.com/tools/index.php/Home/Index/index.html)進(jìn)行GO分類及KEGG代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA seq測(cè)序數(shù)據(jù)概述

對(duì)12個(gè)腸道樣品進(jìn)行深度測(cè)序，獲得的讀段數(shù)都在 26 405 020 條以上，去除低質(zhì)量讀段后的清晰讀段數(shù)達(dá)到 26 405 020 條以上，Q20達(dá)到97%以上，說(shuō)明RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。首先將清晰讀段比對(duì)核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)，最多允許5個(gè)錯(cuò)配，去除比對(duì)上核糖體的讀段，剩余讀段用于比對(duì)意蜂參考基因組(表1、表2)。各樣品比對(duì)上的比例均在86%以上，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。并對(duì)各腸道樣品進(jìn)行主成分分析(PCA)(圖1)，結(jié)果顯示處理組和對(duì)照組樣品的聚類情況良好，說(shuō)明測(cè)序樣品具有較好的重復(fù)性。

2.2 各腸道樣品前100個(gè)高表達(dá)基因的GO分類

一般認(rèn)為FPKM 值在0.10～3.75之間的是低表達(dá)基因，在>3.75～15之間為中度表達(dá)基因，大于15的為高表達(dá)基因，根據(jù)FPKM值對(duì)各樣品基因進(jìn)行排序，選取前100位的高表達(dá)基因進(jìn)行下一步分析。

表1 RNA-seq數(shù)據(jù)過(guò)濾信息統(tǒng)計(jì)

注：括號(hào)內(nèi)為占比，表2同。

表2 Clean reads與參考基因組的比對(duì)信息統(tǒng)計(jì)

將意蜂幼蟲腸道表達(dá)水平最高的100個(gè)基因進(jìn)行GO注釋(圖2)，這100個(gè)高表達(dá)基因主要集中在細(xì)胞組分、生物學(xué)進(jìn)程和分子功能上發(fā)揮作用，AmCK、AmT1和AmT2的高表達(dá)基因GO分類數(shù)均為29個(gè)，AmT3的分類數(shù)有27個(gè)，在細(xì)胞組分方面，基因主要富集在細(xì)胞整體、細(xì)胞部分、胞外區(qū)、大分子復(fù)合物、隔膜、隔膜部分、細(xì)胞器和細(xì)胞器部分；在生物學(xué)進(jìn)程方面，基因主要富集在細(xì)胞進(jìn)程、行為、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞組分起源、發(fā)育進(jìn)程、代謝進(jìn)程、定位、多組織進(jìn)程、多細(xì)胞組織進(jìn)程、繁殖、繁殖進(jìn)程、刺激反應(yīng)、單組織進(jìn)程；在分子功能方面，基因主要富集在抗氧化活性、電子載體活性、結(jié)合(Binding)、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性。此外，富集在細(xì)胞組分中的基因比率高于在分子功能、生物學(xué)進(jìn)程中的基因比率。

AmT1與AmCK比較，同是4日齡，高表達(dá)基因富集的GO分類數(shù)量相同，且分別富集在細(xì)胞組分、生物學(xué)進(jìn)程和分子功能上的基因數(shù)量基本一致，說(shuō)明在脅迫的早期階段，球囊菌尚未喚起意蜂幼蟲的應(yīng)答，AmT1、AmT2、AmT3之間比較，高表達(dá)基因富集的GO分類數(shù)量逐漸下降，且分別富集在細(xì)胞組分、生物學(xué)進(jìn)程和分子功能上的基因數(shù)量也呈逐漸下降的趨勢(shì)，說(shuō)明隨著時(shí)間延長(zhǎng)，球囊菌脅迫增強(qiáng)，意蜂幼蟲的應(yīng)答也逐漸增強(qiáng)。

同時(shí)，GO富集分析結(jié)果顯示，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，富集在代謝過(guò)程和催化活性上的基因數(shù)量呈下降趨勢(shì)，表明隨著球囊菌的增殖破壞了幼蟲腸道的正常代謝功能。

2.3 各腸道樣品前100個(gè)高表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析

對(duì)樣品AmCK、AmT1、AmT2、AmT3表達(dá)水平最高的前100個(gè)基因進(jìn)行KEGG在線分析，結(jié)果顯示這些基因分別富集在94、93、93、83個(gè)代謝通路上(圖3)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)這些高表達(dá)基因主要集中在新陳代謝、有機(jī)體系統(tǒng)、遺傳信息加工、環(huán)境信息加工等6個(gè)途徑上。

2.3.1 新陳代謝 根據(jù)KEGG直系同源號(hào)進(jìn)行分類，AmCK新陳代謝相關(guān)基因涉及脂代謝、碳水化合物代謝、其他氨基酸代謝、氨基酸代謝、能量代謝、萜類和酮類化合物的代謝、外來(lái)物質(zhì)的降解和代謝等8個(gè)代謝途徑。分析結(jié)果顯示，細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ、線粒體ATP合酶脂質(zhì)結(jié)合蛋白、細(xì)胞色素b、細(xì)胞色素C氧化酶Ⅱ(線粒體)4個(gè)編碼蛋白參與能量代謝，酮脂酰CoA硫解酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶S1、類視黃醛脫氫酶參與脂類代謝過(guò)程、α-葡萄糖苷酶前體、山梨糖醇脫氫酶、果糖二磷酸醛縮酶參與碳代謝過(guò)程。精氨酸激酶同工酶、酮脂酰CoA硫解酶、類視黃醛脫氫酶參與氨基酸代謝過(guò)程，在細(xì)胞色素P450通路上的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶S1基因、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶D1型X2基因共同作用，細(xì)胞色素P450是一種含高鐵血紅素的蛋白，作為一種末端氧化酶，細(xì)胞色素P450主要催化機(jī)體內(nèi)源和外源性物質(zhì)在體內(nèi)的氧化反應(yīng)，參與大部分藥物的氧化代謝[13-14]?？梢缘玫蕉鄠€(gè)基因可以參與多個(gè)通路。

2.3.2 遺傳信息加工 遺傳信息加工通路中主要涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、組裝和降解，其中參與翻譯通路高表達(dá)基因占據(jù)一個(gè)很大的比例，其中主要有編碼40S核糖體蛋白基因和60S核糖體蛋白，總共有37個(gè)基因編碼這2類蛋白，翻譯通路中的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)的延伸因子1-α同工酶基因，該基因參與許多重要的細(xì)胞過(guò)程和疾病，包括信號(hào)傳導(dǎo)、翻譯控制、凋亡、細(xì)胞骨架組成、病毒復(fù)制等[15]。熱休克蛋白在涉及轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移、折疊、組裝和降解過(guò)程，該基因參與新生蛋白折疊、組裝加工成有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。

2.3.3 環(huán)境信息加工 在KEGG分析中，環(huán)境信息加工過(guò)程具有2個(gè)方面，分別是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)分子及其相互作用。40S核糖體蛋白S6、 肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白等參與相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)。

2.3.4 細(xì)胞進(jìn)程 細(xì)胞進(jìn)程中高表達(dá)基因主要富集在轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞通訊等3個(gè)方面。天冬氨酸蛋白酶、GL12416、NPC2蛋白質(zhì)、肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白等參與轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝。通路中GL12416基因產(chǎn)物參與吞噬體的形成以及細(xì)胞通訊過(guò)程中的間隙連接，相關(guān)基因還參與溶酶體的形成和作用。肌動(dòng)蛋白參與吞噬體通路過(guò)程，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。同時(shí)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞分泌、吞噬、移動(dòng)、胞質(zhì)流動(dòng)和胞質(zhì)分離等細(xì)胞通訊過(guò)程中起重要作用。

2.3.5 有機(jī)體系統(tǒng) 有機(jī)體系統(tǒng)主要包括免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等9個(gè)系統(tǒng)。超氧化物歧化酶、熱休克蛋白等蛋白參與有機(jī)體系統(tǒng)。熱休克蛋白參與MPKM通路，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與介導(dǎo)生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、分化、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種細(xì)胞過(guò)程，MAPK能被多種炎性刺激激活，并對(duì)炎癥的發(fā)生、發(fā)展起重要調(diào)控作用[16-17]。

2.4 對(duì)照組與處理組間比較

意蜂幼蟲腸道AmCK、AmT1、AmT2之間的差異性不大，高表達(dá)基因富集在新陳代謝、有機(jī)體系統(tǒng)、遺傳信息加工、環(huán)境信息加工和細(xì)胞進(jìn)程上的代謝通路數(shù)基本一致。AmT3相對(duì)于AmCK具有一些特異性基因，特異性表達(dá)出一些抗菌肽、防御素前體蛋白物質(zhì)等，抗菌肽指昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，抗菌肽對(duì)部分真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有強(qiáng)有力的殺傷作用[18-19]，說(shuō)明隨著球囊菌脅迫時(shí)間的增加，幼蟲腸道誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽。

2.5 處理組間比較

在球囊菌脅迫前期(AmT1、AmT2)，高表達(dá)基因富集在新陳代謝、有機(jī)體系統(tǒng)、遺傳信息加工、環(huán)境信息加工和細(xì)胞進(jìn)程上的代謝通路數(shù)基本一致，而在AmT3脅迫后期，高表達(dá)基因富集在新陳代謝上的代謝通路數(shù)大幅下降，并且免疫性物質(zhì)增加，再次說(shuō)明球囊菌對(duì)意蜂幼蟲的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，防御機(jī)制開(kāi)始發(fā)揮作用。

KEGG代謝通路富集分析結(jié)果(表3至表6)顯示，AmCK、AmT1、AmT2和AmT3中基因富集量最多的都為核糖體通路，但是富集的基因數(shù)量呈逐漸下降的趨勢(shì)，說(shuō)明球囊菌破壞了宿主的蛋白合成系統(tǒng)，推測(cè)球囊菌能通過(guò)互作減少宿主的營(yíng)養(yǎng)供給，從而促進(jìn)自身增殖。

表3 AmCK組基因富集量前10位KEGG代謝通路統(tǒng)計(jì)

表4 AmT1樣品基因富集量最多的前10個(gè)KEGG代謝通路

表5 AmT2樣品基因富集量最多的前10個(gè)KEGG代謝通路

2.6 各腸道樣品前100個(gè)高表達(dá)基因的Venn分析

對(duì)處理組和對(duì)照各幼蟲腸道樣品的Venn分析結(jié)果顯示， 72個(gè)高表達(dá)基因?yàn)锳mCK、AmT1、AmT、AmT3所共有，各樣品中的特有高表達(dá)基因分別為1、2、2、13個(gè)，特有的高表達(dá)基因大多是編碼抗菌肽、防御素前體、鐵蛋白、抑制劑等免疫方面的基因，推測(cè)這些共有基因在球囊菌侵染的全過(guò)程都發(fā)揮著重要功能，而少數(shù)特有基因則在病程的各個(gè)階段分別發(fā)揮作用，對(duì)這些共有與特有高表達(dá)基因的深入研究將有助于揭示意蜂幼蟲的應(yīng)答機(jī)制(圖4)。

表6 AmT3樣品基因富集量最多的前10個(gè)KEGG代謝通路

3 討論

本研究選取意蜂幼蟲腸道作為測(cè)序材料，因?yàn)槟c道是球囊菌侵染的主要場(chǎng)所，其轉(zhuǎn)錄組變化能更準(zhǔn)確地反映意蜂幼蟲對(duì)球囊菌入侵的應(yīng)答。為了從全局水平了解意蜂幼蟲受球囊菌脅迫前后的基因表達(dá)譜，本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)正常幼蟲腸道和球囊菌脅迫的幼蟲腸道進(jìn)行深度測(cè)序，通過(guò)比對(duì)意蜂參考基因組，共發(fā)現(xiàn)有13 592個(gè)基因在幼蟲腸道中表達(dá)，其中已知基因有11 918個(gè)(87.68%)，另有197個(gè)新基因，這些新基因?qū)橥晟埔夥浠蚪M信息提供一定補(bǔ)充。

Venn分析結(jié)果顯示，4個(gè)腸道樣品中的共有高表達(dá)基因有72個(gè)，比如部分參與核糖體通路的基因，合成加工成供幼蟲自身生長(zhǎng)發(fā)育需要的物質(zhì)，也有參與核糖體通路的U-box結(jié)構(gòu)域蛋白基因，可作為分子伴侶或輔分子伴侶，還可能作為剪接體的部分因子，識(shí)別細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊或異常蛋白質(zhì)，從而使其正確折疊或降解。另外，U-BOX蛋白質(zhì)還與癌病變以及自身免疫性疾病等病理過(guò)程有關(guān)，該類蛋白質(zhì)通常還在將底物轉(zhuǎn)運(yùn)給蛋白體的過(guò)程中起作用，調(diào)節(jié)著體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解[20]。各樣品中的特有高表達(dá)基因分別有1、2、2、13個(gè)，對(duì)比處理組樣品和對(duì)照組樣品中的特有高表達(dá)基因，將有可能是意蜂幼蟲響應(yīng)球囊菌脅迫的關(guān)鍵應(yīng)答基因，基因編碼的核苷酸結(jié)合蛋白β亞基1在AmT3上特異性表達(dá)，該蛋白特異性結(jié)合抗原，可以起到抗體的作用，在抵御侵染上起到一定作用。對(duì)比處理組各樣品中的特有高表達(dá)基因，或許能為明確球囊菌脅迫過(guò)程不同階段的關(guān)鍵應(yīng)答基因提供重要線索，這些特有高表達(dá)基因值得進(jìn)一步研究。

由于經(jīng)費(fèi)限制，本研究只設(shè)4日齡正常幼蟲腸道作為對(duì)照組，會(huì)導(dǎo)致一些基因表達(dá)信息的缺失，因此，對(duì)4、5、6日齡正常幼蟲腸道分別取樣并同時(shí)進(jìn)行深度測(cè)序，便于更全面地獲得意蜂幼蟲響應(yīng)球囊菌脅迫的基因表達(dá)譜信息。

本研究中，在進(jìn)行RNA-seq數(shù)據(jù)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)有部分reads不能定位于已有的意蜂參考基因組，它們有可能是尚未克隆的新基因，這些新基因也許在意蜂幼蟲腸道發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)正常和球囊菌脅迫意蜂幼蟲腸道進(jìn)行深度測(cè)序，通過(guò)對(duì)各樣品表達(dá)量水平最高的前100個(gè)基因進(jìn)行GO分類和KEGG代謝通路富集分析，初步解析了意蜂幼蟲響應(yīng)球囊菌脅迫的應(yīng)答，推測(cè)在6日齡之后免疫機(jī)制迅速增強(qiáng)，應(yīng)答機(jī)制的深入闡釋有賴于差異表達(dá)基因的進(jìn)一步研究。