液體培養(yǎng)富硒富鍺蜜環(huán)菌的探討

賀建超，馬英輝，李利軍，盧美歡

(陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043)

蜜環(huán)菌(Armillariellamellea)屬真菌界、擔子菌門、擔子菌綱、傘菌目、口蘑科、蜜環(huán)菌屬，同蘭科天麻(Gastrodiaelata)互為寄生。天麻染此菌后，菌索迅速消失，進而共同生長發(fā)育。天麻開花結籽后，蜜環(huán)菌又迅速吃掉天麻塊莖。夏秋雨季蜜環(huán)菌常見于針、闊葉樹干基部叢生，使樹根腐至可發(fā)熒光。蜜環(huán)菌深層發(fā)酵物功同天麻，有息風鎮(zhèn)痛，治神經性頭疼，高血壓性頭痛之效。均對中樞神經起鎮(zhèn)靜作用，可與中樞抑制劑，戊巴比妥納協(xié)同作用，延長小白鼠睡眠。與中樞興奮劑五甲烯四氫唑拮抗，增進大腦和冠狀動脈血流量。舒筋活絡，強筋壯骨。治腰腿疼痛，半身不遂，佝僂癥[1]。

有機硒具有抗氧化、抗衰老、抗癌、提高機體免疫力等多種生物學功能。我國硒資源儲量豐富，但地理分布不均勻，城鄉(xiāng)居民硒攝入量不足，是公認的缺硒大國。近十多年來，我國富硒農產品備受市場關注和青睞，呈現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景[2]。有機鍺具有抗癌誘發(fā)機體干擾素的產生降低血壓提高機體免疫等功能并且毒性極低， 由于名貴藥材如靈芝、猴頭菌、蜜環(huán)菌等中有機鍺含量較低，近年來國內外有研究報道用二氧化鍺作為添加劑培養(yǎng)食用和藥用真菌，獲得高含量的生物源有機鍺[3]。筆者選用不同的培養(yǎng)基，添加不同含量的亞硒酸鈉和二氧化鍺進行研究?，F(xiàn)將實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

蜜環(huán)菌AY3菌株，系陜西省微生物研究所真菌研究中心保藏菌種。

綜合PDA液體培養(yǎng)基[4]。土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母膏1 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，維生素B1為10 mg，水1 000 mL。

添加劑亞硒酸鈉(化學純，上海試劑廠)；二氧化鍺(高純試劑，上海試劑廠)。

1.2 方法

將綜合PDA液體培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖替換成麥芽糊精、紅薯淀粉、土豆淀粉、可溶性淀粉，分裝在三角瓶中，每瓶100 mL，于1.2 kg·cm-2滅菌30 min。冷卻至25 ℃，接種蜜環(huán)菌，25 ℃下靜置培養(yǎng)21 d，過濾菌索體，烘干稱重。

采用綜合PDA液體培養(yǎng)基分裝三角瓶，每瓶100 mL，在1.2 kg·cm-2壓力下滅菌30 min。冷卻至25 ℃，接種蜜環(huán)菌，25 ℃下培養(yǎng)7 d，分別添加亞硒酸鈉0、50、100、150、200、250、300、350、400 mg·L-1[5-6]；分別添加二氧化鍺0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 mg·L-1，25 ℃下靜置再培養(yǎng)14 d[7-8]，過濾菌索體，烘干稱重。

蜜環(huán)菌粗多糖提取方法[9-10]。稱取蜜環(huán)菌菌索粉5 g，加入50 mL蒸餾水，攪拌均勻，于95 ℃水浴中保溫4 h，中間每隔20 min超聲震動20 s，完成后3 500轉離心20 min，得上清液(1)。再加入50 mL蒸餾水攪拌均勻，于95 ℃水浴中保溫4 h，中間每隔20 min超聲震動20 s，再提取1次，離心后得上清液(2)。將上清液(1)和(2)合并，加入總體積3倍的無水乙醇，于4 ℃冰箱靜置沉淀48 h。3 500轉離心后得沉淀于80 ℃烘干，即為蜜環(huán)菌粗多糖樣品。

蜜環(huán)菌粗多糖含量測定采用苯酚硫酸法[11]。精密稱取蜜環(huán)菌菌索粉1 g，置索氏提取器中，先用無水乙醇加熱回流后，再加水90 mL，加熱回流提取至無色，將提取液轉移至100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 mL，加入無水乙醇150 mL搖勻，4 ℃放置12 h取出，離心，棄上清液加水溶解，并定量轉移至50 mL容量瓶中稀釋至刻度。

標準曲線繪制。精密稱取葡萄糖對照品配成0.1 mg·mL-1溶液，用移液槍分別吸取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，置10 mL具塞試管中，加水至2 mL，加入1 mL 5%苯酚，再緩慢加入5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴顯色20 min，冷卻后490 nm測吸光值。標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線濃度

樣品測定。取蜜環(huán)菌提取液0.5 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2 mL，加入1 mL苯酚，再緩慢加入5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴顯色20 min，冷卻后490 nm測吸光值。重復3次，取平均值計算多糖含量。

2 結果與分析

2.1 碳源對蜜環(huán)菌發(fā)酵的影響

由圖2可知，葡萄糖、麥芽糊精、土豆淀粉、紅薯淀粉、可溶性淀粉，蜜環(huán)菌菌索生物量干重分別為14.15、18.05、11.95、13.40、14.45 g·L-1。

圖2 不同碳源對蜜環(huán)菌發(fā)酵的影響

2.2 亞硒酸鈉對蜜環(huán)菌的影響

由圖3可知，添加亞硒酸鈉0、50、100、150、200、250、300、350、400 mg·L-1，蜜環(huán)菌菌索生物量干重分別為18.0、19.2、20.1、21.3、22.2、23.1、25.6、24.3、20.2 g·L-1，蜜環(huán)菌粗多糖含量分別為18.63、18.61、19.53、20.01、21.20、22.30、23.60、22.30、20.10 mg·g-1。

圖3 添加硒對蜜環(huán)菌的影響

2.3 二氧化鍺對蜜環(huán)菌的影響

由圖4可知，添加二氧化鍺對照0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600 mg·L-1，蜜環(huán)菌菌索生物量干重分別為10.4、9.0、10.75、10.7、10.5、11.3、12.4、12.8、13.0、13.4、15.6、15.6、15.0 g·L-1，蜜環(huán)菌粗多糖含量5.82、5.81、6.04、6.10、5.98、6.12、6.14、6.20、6.21、6.35、7.86、7.46、7.15 mg·g-1。

圖4 添加鍺對蜜環(huán)菌的影響

2.4 混合添加對蜜環(huán)菌的影響

添加硒300 mg·L-1和鍺500 mg·L-1，蜜環(huán)菌生長不良，菌索生物量為3.5 g·L-1。硒和鍺均添加1.5 μg·mL-1則生長良好，蜜環(huán)菌菌索生物量為12.95 g·L-1。

蜜環(huán)菌多糖含量。對照多糖含量為20 mg·g-1，添加硒100 mg·L-1后多糖含量為30 mg·g-1，添加鍺400 mg·L-1后多糖含量40 mg·g-1，添加硒100 mg·L-1和添加鍺400 mg·L-1后的多糖含量為36.67 mg·g-1，添加硒150 mg·L-1和添加鍺450 mg·L-1后的多糖含量為30 mg·g-1。

3 小結與討論

在5種碳源中，麥芽糊精的蜜環(huán)菌生物量最高，達18.05 g·L-1。當亞硒酸鈉添加量350 mg·L-1時，生物量和粗多糖含量開始下降；當亞硒酸鈉添

加量為300 mg時，蜜環(huán)菌的生物量和粗多糖含量均為最高值。當二氧化鍺添加量為600 mg·L-1時，生物量和粗多糖含量開始下降；當二氧化鍺添加量為500 mg·L-1時，蜜環(huán)菌的生物量和多糖含量均為最高值。

低濃度微克級硒和鍺能促進蜜環(huán)菌菌絲生長，其機理可能是硒和鍺可進入細胞內部并與有機羧酸絡合成硒鹽和鍺鹽從而影響細胞某些酶類的活性變化。高濃度的硒和鍺混合添加可抑制蜜環(huán)菌菌索的生長，低濃度(微克級)的硒和鍺混合添加對蜜環(huán)菌菌索抑制不大，微克級的硒和鍺對人毒性小。每天口服1 g添加1.5 μg·mL-1硒鍺蜜環(huán)菌菌索粉對人體無毒，具有鎮(zhèn)靜安眠作用，還具有降低血糖和抗癌防癌的功效。2011年中國營養(yǎng)學會最新推薦成人每天硒攝入量為60～250 μg。建議添加微克級硒和鍺，因為高濃度的硒和鍺對蜜環(huán)菌和人體有毒害作用。