基于Web of Sciences數據庫的我國禾草內生真菌學研究論文計量分析

師茜，田沛，南志標

(蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020)

禾草內生真菌(grass endophyte fungi)是指在禾草中度過全部或大部分生命周期，而禾草不顯示外部癥狀的一大類真菌[1-2]，屬麥角菌科(Clavicipitaceae)香柱菌屬(Epichlo?)[3-5]。其無性型多存在于禾本亞科(Pooideae)的冷季型牧草中，通過種子進行垂直傳播。在頻繁刈割、踐踏和采食的情況下，無性型內生真菌也會發(fā)生水平傳播。有性型內生真菌則通過產生子座在宿主間進行水平傳播。大量的研究表明，存在于我國的禾草內生真菌均為無性型Epichlo?內生真菌[6-9]。Leuchtmann 等[10]根據內生真菌的系統(tǒng)發(fā)育和形態(tài)特征，依據 “一種真菌一個名稱”的命名原則，將已發(fā)表鑒定的18種有性世代(Epichlo?)和25種無性世代(Neotyphodium)內生真菌均劃分為Epichlo? 屬內生真菌，原本Neotyphodium屬認為暫時沒有發(fā)現(xiàn)其有性世代，也被冠以Epichlo?屬[6,11]。

1977年，Bacon等[12]從高羊茅(Festucaarundinacea)中分離得到內生真菌。19世紀80年代初，有學者發(fā)現(xiàn)與多年生黑麥草(Loliumperenne)共生的內生真菌(Epichlo?festucaevar.lolii)有益于宿主植物的生長后[13]，內生真菌成為牧草及草坪草研究的重要組成部分。大量的研究證明，內生真菌可提高禾草的耐旱性[14]、耐鹽性[15]、耐寒性[16]、抗病性[17]，并能夠促進營養(yǎng)物質的吸收、提高牧草產量[18-19]。大部分內生真菌在宿主體內產生生物堿，目前為止，內生真菌與禾草共生時產生的生物堿主要有吲哚雙萜類(indole diterpenes)，麥角堿(ergot alkaloids)，波胺(peramine)和黑麥草堿(lolines)，除peramine外的其余3類生物堿均對哺乳動物有毒，其中毒性較強的是lolitrem B和ergovaline，分別是引致狐茅中毒癥和黑麥草蹣跚病的主要原因，給畜牧業(yè)帶來了巨大損失[11,20-24]。因此，禾草內生真菌的雙重特性引起了許多國際學者的興趣，成為國際研究熱點之一[2]。我國對禾草內生真菌的研究始于20世紀。1996年，南志標團隊率先對禾草內生真菌進行了初步研究，在《草業(yè)學報》和《草業(yè)科學》刊物上共發(fā)表研究論文3篇[25-27]，這引起了國內學者對禾草內生真菌研究領域的廣泛關注。為了使禾草內生真菌更好地造福人類，近20多年來，我國科研工作者立足我國禾草資源，在禾草內生真菌領域展開了大量的研究并發(fā)表了一系列的論文。

通過對特定主題文獻數量的統(tǒng)計，有助于了解其科學發(fā)展的狀況。目前與禾草內生真菌研究的相關論文的系統(tǒng)分析尚未見報道。因此，本研究從文獻信息學的角度，以禾草內生真菌為主題，采用文獻計量方法，對1996-2016年間美國Web of Science數據庫中，我國科研人員發(fā)表的禾草內生真菌文獻進行數量統(tǒng)計和分析，揭示我國科研工作者在該領域的研究動態(tài)。這有助于掌握禾草內生真菌研究的最新發(fā)展動態(tài)，為我國禾草內生真菌學后續(xù)的發(fā)展提供文獻參考。

1 文獻獲取及數據分析方法

采用大型綜合性、多學科引文索引的美國科學信息研究所(ISI)Web of Knowledge的Web of Science數據庫，選用普通檢索方式，以“Epichlo?”或“Neotyphodium”為關鍵詞，在該數據庫內檢索1996-2016年間相關文獻題錄數據。手動排除與本研究主題不符、內容無關的文獻，篩選得到與禾草內生真菌相關的研究文獻共計1042篇(包括港、澳、臺地區(qū))。統(tǒng)計文獻的年份、數量、影響因子、H指數、發(fā)表期刊、主要科研機構、研究方向等信息，對論文發(fā)文量、發(fā)表期刊、論文影響因子的分布、研究機構、主要研究領域以及高倍引用論文進行分析。其中，影響因子是指某年引用某期刊前兩年論文的總次數與前兩年該期刊發(fā)表的論文總數的比值，它是國際上通行的期刊評價指標[28]。H指數是指一個國家(或機構、科研人員)最多有H篇論文分別被引用了最少H次，該值越高，表明它的論文影響力越大[29]。

2 結果與分析

2.1 全球發(fā)文趨勢及國家分析

1996-2016年間，Web of Science 數據庫收錄的禾草內生真菌研究相關論文共計1042篇，發(fā)文國家共31個。之后，選取發(fā)文量排名前10名的國家進行統(tǒng)計(表1)。美國、新西蘭的發(fā)文量和H指數(high citiations)領先于其他國家，瑞士的平均被引次數最高，因此國際上對于禾草內生真菌研究的主要力量分布在美國、新西蘭和瑞士這3個國家。雖然我國禾草內生真菌研究相對于美國、新西蘭、瑞士、阿根廷、澳大利亞、日本等國家起步較晚，但是到2016年，我國禾草內生真菌研究發(fā)文量已迅速超越許多國家，國際排名躍居第4。

選取發(fā)文量前5位的國家，按發(fā)表年份匯總(圖1)。1996-2016年之間，美國、新西蘭、阿根廷、瑞士、中國5個國家的年發(fā)文數量雖然波動較大，但整體呈緩慢上升的變化趨勢。我國對禾草內生真菌研究的首篇論文是在1998年由清華大學學者Ju等[30]在Journal of Agriculture and Food Chemistry上發(fā)表的題為“Bioactive flavonoids from endophyte-infected blue grass (Poaampla)”的文章，該文對感染和不感染Neotyphodium內生真菌的巨早熟禾(Poaampla)不同部位的乙醇、乙酸乙酯、正己烷提取物的殺蟲活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)感染Neotyphodium內生真菌的巨早熟禾具有抗蚊子幼蟲的活性，然而未對其攜帶的內生真菌及其他生理及生化方面進行研究，跟蹤檢索發(fā)現(xiàn)該作者后來也并未發(fā)表內生真菌相關文獻。因此，嚴格意義上講這并不能算中國對禾草內生真菌方面研究的初始元年。2004年后，自蘭州大學南志標院士團隊從醉馬草(Achnatheruminebrians)中分離得到甘肅內生真菌并正式命名為：Epichlo?gansuensisSchardl, comb. nov.[10,31]開始之后,國內科研工作者逐步展開對禾草內生真菌的研究[5]。

表1 1996-2016年間，發(fā)表禾草內生真菌發(fā)文總量居前10的國家Table 1 Top 10 countries of publishing article on grass endophyte fungi during 1996-2016

2.2 1996-2016年間我國發(fā)表禾草內生真菌文獻期刊分布

圖1 1996-2016年間，總發(fā)文量前五的國家年發(fā)文情況分析Fig.1 The dynamic of top 5 countries publishing articles on grass endophytic fungi during 1996 to 2015

表2列出了收錄我國禾草內生真菌研究論文數量排名前15的期刊。我國的66篇論文發(fā)表于42個期刊，其中有25個期刊分別各收錄1篇，F(xiàn)ungal Ecology，Mycologia和Symbiosis是刊登我國禾草內生真菌論文的三大主要期刊(表2)。發(fā)表在影響因子小于1，介于1～2、2～3、3～4、4～5，大于5的期刊論文數量分別占7.75%、24.24%、46.97%、12.12%、4.54%、4.54%(圖2)。2007年，由南開大學高玉葆教授團隊發(fā)表在Fungal Diversity(IF2016=13.465)期刊的題為“Distribution and diversity ofEpichlo?/Neotyphodiumfungal endophyte from different populations ofAchnatherumsibiricum(Poaceae) in the Inner Mongolia Steppe, China”的論文[32]，是目前我國學者以第一作者身份在禾草內生真菌領域中發(fā)表的影響因子最高的論文。隨著我國禾草內生真菌研究的深入，不斷有論文發(fā)表于Plant and Soil (IF2016=3.052，農林1區(qū))[15]、Journal of Agricultural and Food Chemistry (IF2016=3.154，農林1區(qū))[33]、Scientific Reports(IF2016=4.259，綜合2區(qū))[34]等高水平期刊。

表2 刊登我國禾草內生真菌研究最多的15種期刊Table 2 Top 15 journals of publishing articles on grass endophyte fungi during 1996 to 2016

2.3 關鍵詞分析

圖2 1966-2016年我國禾草內生真菌論文影響因子分布Fig.2 Distribution of impact factors of the articles on grass endophyte fungi published by Chinese scientists during 1996 to 2016

關鍵詞是對論文的研究內容、方法、對象等的高度概括，從關鍵詞的分布可以看出相應研究領域的研究熱點、創(chuàng)新及發(fā)展趨勢。表3列出了66篇論文中出現(xiàn)頻次排名前10的關鍵詞共計10個。通過關鍵詞分析可知，醉馬草(Achnatheruminebrians)和羽茅(Achnatherumsibiricum)為主要研究對象，禾草內生真菌資源挖掘，產堿特性以及其對生態(tài)系統(tǒng)的作用，內生真菌提高宿主植物抗旱性、抗寒性、抗鹽性的生理生化機制研究是我國禾草內生真菌主要的研究熱點。

1)我國有著豐富的禾草資源，超過77種禾草被認為攜帶有Epichlo?內生真菌，已知帶菌的禾草存在于芨芨草屬(Achnatherum)、冰草屬(Agropyron)、剪股穎屬(Agrostis)、短柄草屬(Brachypodium)、雀麥屬(Bromus)、拂子茅屬(Calamagrostis)、隱子草屬(Cleistogenes)、鴨茅屬(Dactylis)、發(fā)草屬(Descampsia)、披堿草屬(Elymus)、偃麥草屬(Elytrigia)、畫眉草屬(Eragrostis)、羊茅屬(Festuca)、大麥屬(Hordeum)、賴草屬(Leymus)、臭草屬(Melica)、溚草屬(Koeleria)、早熟禾屬(Poa)、鵝觀草屬(Roegneria)、針茅屬(Stipa)[2,6]。目前為止已從我國禾草中分離鑒定的內生真菌有9種，其中7種為新種[6]。禾草內生真菌資源的挖掘，有助于整體認識和理解內生真菌的系統(tǒng)發(fā)育過程以及優(yōu)良禾草的選育和改良。2)禾草內生真菌共生體產生的生物堿可在宿主體內積累，幫助其防御捕食者，進而對上一級營養(yǎng)層甚至生態(tài)系統(tǒng)中多級營養(yǎng)層產生影響。此外，研究發(fā)現(xiàn)對家畜具有毒害作用的醉馬草-內生真菌共生體有利于維護草原植物和節(jié)肢動物的多樣性，為草原生態(tài)系統(tǒng)的建立提供了新視野[35]。3)干旱是影響植物生存、生長和分布的最重要的非生物脅迫之一。內生真菌能夠提高共生體的耐旱性主要是在干旱條件下寄主植物經過一系列形態(tài)和生理的適應和調整來適應環(huán)境，這些適應和調整使寄主植物能及早避免水分丟失，增強對干旱的抵抗力和提高干旱結束后的恢復力[2,35]。我國對禾草內生真菌提高宿主抗非生物與非生物脅迫的生理生化機制也進行了大量的研究[15,36-42]，這有利于進一步深入理解禾草與內生真菌的共生關系。

表3 出現(xiàn)頻次排名前10 的關鍵詞Table 3 The frequency of the key words published in top 10

2.4 論文被引情況分析

我國禾草內生真菌研究領域被引次數最高的前 10篇論文見表4。 從10篇高被引用論文研究內容來看，禾草內生真菌新種的發(fā)現(xiàn)、對生物脅迫與非生物脅迫的抗性以及生物堿類次生代謝產物研究的關注度最高。分子生物學相關的研究論文占2篇，均側重于對生物堿合成基因的分析，其中一篇的被引次數達116，而另一篇被引次數為34。可見分子生物學為禾草內生真菌的研究提供了新技術、新方法，禾草內生真菌在分子生物學方面的研究已成為當前該研究領域的活躍部分。而關于新種的挖掘、內生真菌與宿主的互作的論文也有較高的引用率。近年來，隨著分子生物學、基因組學、代謝組學、生物信息學的快速發(fā)展以及在植物和真菌學領域內的廣泛應用，世界禾草內生真菌的研究方向主要集中在內生真菌與寄主相互作用的分子機制以及利用內生真菌進行牧草和草坪草育種等方面[11]。相應地，我國也積極開展了對禾草內生真菌在分子方面的研究，代表性工作有：利用特定DNA片段如tubB、tefA序列研究內生真菌以及相關宿主進行遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、起源和進化[43-45]；對內生真菌提高醉馬草種子萌發(fā)的轉錄組學進行分析[45]，均取得了一定的研究成果。

表4 1996-2016年，禾草內生真菌研究前10篇高被引論文Table 4 Top 10 most cited articles in the field of grass endophyte fungi during 1996 to 2016

3 討論

近年來，隨著分子生物學、基因組學、代謝組學、生物信息學的快速發(fā)展以及在植物和真菌學領域內的廣泛應用，國際禾草內生真菌的研究主要集中在內生真菌與寄主相互作用的分子機制以及利用內生真菌進行牧草和草坪草育種等方面[11]，例如：基于基因敲除技術開展的單個目標基因的研究，闡釋了維持內生真菌與宿主動態(tài)平衡的分子機制[44-45]；對peramine、ergot和loline生物堿的生物合成途徑、調控基因以及其所編碼的酶已有了深入研究，明確了次生代謝物多樣性與基因的關系[27,48]；利用基因組學等技術篩選對家畜無毒的內生真菌菌株，通過接種技術建立新的既具有抗逆，又對家畜無毒的禾草-內生真菌共生體，提高禾草品質并確保對動物的安全性[48-49]。

雖然我國禾草內生真菌已取得了長足的進步，但是與美國、新西蘭等國家還存在一定的差距。由文獻計量分析發(fā)現(xiàn)，未來我國禾草內生真菌研究可能在以下方面具有較大發(fā)展?jié)摿Γ?)禾草內生真菌的分類地位評價。目前為止，已從我國禾草中分離鑒定的內生真菌有9種，其中7種為新種，但一部分內生真菌未鑒定至種的水平；2)禾草內生真菌遺傳進化、功能基因、比較基因組方面的研究。我國對內生真菌提高宿主禾草抗生物與非生物脅迫、產生物堿進行了大量的研究，但是在遺傳進化、功能基因、比較基因組方面的研究較少；3)生物農藥資源開發(fā)和利用。Song等[33]已從披堿草內生真菌中分離純化出具有類似除草劑活性生物化合物，對多年生黑麥草和早熟禾幼苗生長具有明顯的抑制作用。內生真菌是豐富的天然產物資源庫，孕育著多種新型化合物，利用這些新型化合物創(chuàng)制出更有效、環(huán)保的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑等生物農藥，具有廣闊的應用前景。

此外，我國需加強在禾草內生真菌領域的投入。包括人才的培養(yǎng)和引進，國際合作與交流，以及增加科研所需的各種軟硬件投入。不斷提升禾草內生真菌領域的科研水平，推動我國禾草內生真菌研究事業(yè)的發(fā)展，縮短與其他國家的差距，進一步提升我國在禾草內生真菌研究領域的國際影響力，積極發(fā)揮禾草內生真菌對農業(yè)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境可持續(xù)應有的貢獻和價值。積極推動草地農業(yè)智庫系統(tǒng)的構建，深入研究禾草內生真菌在草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的作用，助力中國農業(yè)結構轉型[50]。