參葵湯對卵巢癌模型大鼠淋巴細(xì)胞、免疫球蛋白及相關(guān)炎癥因子的影響*

霍 亮,葛倩倩

1.河南省信陽市中心醫(yī)院腫瘤外科一病區(qū)(信陽 464000),2.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 (鄭州450007)

主題詞 卵巢囊腫/中醫(yī)藥療法 @參葵湯 動物實驗 大鼠 T-淋巴細(xì)胞亞群

卵巢癌發(fā)病率占婦科腫瘤第三位，但其病死率居婦科腫瘤之首，嚴(yán)重威脅著女性健康。近年來，隨著人們對免疫原性的理解逐漸深入，卵巢癌的免疫療法引起了研究人員的重視，提高機體的免疫功能成為了一種新的抗腫瘤思路[1-2]。參葵湯作為一種扶正祛邪方藥，能夠增強機體免疫力，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本實驗通過研究參葵湯對卵巢癌模型大鼠淋巴細(xì)胞、免疫球蛋白及相關(guān)炎癥因子的影響，探討傳統(tǒng)中藥治療卵巢癌的作用機制，為臨床提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

1 動物及試劑 雌性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量110～140 g，鼠齡8周，購自中國科學(xué)院動物中心；低分化卵巢癌NUTU-19細(xì)胞株購自Sigma公司；試劑盒購自北京博奧生物有限公司。

2 方劑組成 參葵湯組成：龍葵、黃芪各30 g，苦參、墓頭回、山慈菇、女貞子各20 g，當(dāng)歸12 g，莪術(shù)、甘草各6 g。每劑327 g，煎至200 ml。

3 實驗方法

3.1 動物模型建立及分組:取卵巢癌NUTU-19細(xì)胞株培養(yǎng)至2×107個/ml，接種于雌性Wistar大鼠右側(cè)腋窩皮下，飼養(yǎng)10 d后，若接種位置出現(xiàn)約4 mm×4 mm的腫瘤則認(rèn)為造模成功[3]。將90只造模成功的大鼠隨機分為模型組、順鉑組和中藥組，每組各30只。

3.2 給藥方法: 中藥組每日空腹時灌注所煎中藥2 ml，2 d/次，連續(xù)灌服5次；順鉑組每日腹腔注射注射用順鉑(國藥準(zhǔn)字H37021358)2 mg/kg，2 d/次，連續(xù)注射5次；模型組腹腔灌注與順鉑等體積的生理鹽水，2 d/次,連續(xù)注射5次。給藥結(jié)束后，取大鼠的血清進行檢測。

3.3 樣本測定方法:血清炎性因子IL-2、TNF-α測定方法為，抽取大鼠腹主動脈血液裝在不含抗凝劑的采血管中，室溫下放置20～30 min，自然凝集后離心分離血清，利用酶聯(lián)免疫吸附法測定IL-6、TNF-α含量。

T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+、CD8+)百分率：對外周血進行淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離，對有核細(xì)胞染色標(biāo)記30 min，吸走上清液，清洗兩次后檢測CD4+、CD8+水平。

血清中IgG、IgM測定：采用單項輻射狀免疫擴散法對血清中IgG、IgM進行測定。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示計量資料，組間比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗分析數(shù)據(jù)資料，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠血清炎性因子和免疫球蛋白比較 見表1。經(jīng)過為期10 d的喂養(yǎng)，與模型組比較發(fā)現(xiàn)順鉑組和中藥組血清炎性因子IL-6、TNF-α水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；順鉑組與中藥組相比，血清炎性因子IL-6、TNF-α無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較發(fā)現(xiàn)順鉑組和中藥組免疫球蛋白IgG、IgM水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；順鉑組與中藥組相比，免疫球蛋白IgG、IgM水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較 見表2。與模型組比較發(fā)現(xiàn)順鉑組和中藥組CD4+百分率明顯增高，兩組較模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，順鉑組與中藥組相比CD4+百分率無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；順鉑組和中藥組CD8+百分率較模型組降低明顯，兩組較模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，中藥組與順鉑組相比CD8+百分率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；順鉑組和中藥組CD4+/CD8+較模型組明顯增高，兩組較模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，順鉑組較中藥組相比CD4+/CD8+明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠血清炎性因子和免疫球蛋白比較

注：t1、P1代表順鉑組與模型組比較；t2、P2代表中藥組與模型組比較；t3、P3代表中藥組與順鉑組比較

表2 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較

注：t1、P1代表順鉑組與模型組比較；t2、P2代表中藥組與模型組比較；t3、P3代表中藥組與順鉑組比較

討 論

卵巢癌作為婦科腫瘤中死亡率最高的腫瘤，近年來發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重威脅著女性健康[4-6]。2018年發(fā)布的卵巢癌的大數(shù)據(jù)研究表明，自2003年至2010年間我國卵巢癌發(fā)病率呈上升趨勢，新發(fā)病例和死亡病例也居高不下。單2015年我國就有52100名女性被確診為卵巢癌，約22500例患者死于卵巢癌[7-9]。卵巢癌發(fā)病初期并無明顯癥狀，約70%的患者確診時已是中晚期，喪失了手術(shù)機會，并且單純的化療控制卵巢癌復(fù)發(fā)率高，不良反應(yīng)多，因此，迫切的需要尋求一種能夠有效抑制腫瘤生長，減少不良反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量的新型藥物。中醫(yī)學(xué)中卵巢癌屬于“石瘕”、“癥瘕”之癥，參葵湯作為扶正祛邪方藥，對于治療氣虛血瘀型卵巢癌有確切的療效[10]。其成分主要有以苦參、龍葵為君藥，有清熱解毒，利濕消腫之功效；山慈菇、墓頭回、莪術(shù)為臣藥，有破血散結(jié)，助主藥攻毒之功效；黃芪、女貞子、當(dāng)歸等為佐藥，有益氣養(yǎng)血之功效；甘草為使藥。苦參中含有苦參堿，有抗癌活性[11]，苦參堿能夠有效降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞抑制P815腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)；龍葵中的龍葵堿有抗腫瘤細(xì)胞核分裂的作用，大量研究標(biāo)明龍葵堿能夠表現(xiàn)出明確的細(xì)胞毒性作用。

本研究主要目的是為了研究參葵湯對卵巢癌大鼠模型的干預(yù)機制，并同傳統(tǒng)化療藥物順鉑作比較，使實驗更有說服力。血清炎性因子IL-6主要由Th2細(xì)胞分泌，它能夠促使機體B細(xì)胞前體產(chǎn)生抗體細(xì)胞，使得自然殺傷細(xì)胞的裂解功能增強，通過檢測IL-6能夠預(yù)測機體的免疫狀態(tài)。大量的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在腫瘤患者體內(nèi)是過量合成和分泌的，并且腫瘤患者自身的免疫功能受其抑制。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，給予卵巢癌模型大鼠腹腔注射參葵湯和順鉑均能夠使得IL-6、TNF-α水平顯著降低。免疫球蛋白IgG、IgM作為機體最重要的免疫分子是機體對抗外來入侵的主要物質(zhì)，其濃度的高低能間接的反映機體免疫應(yīng)答的強弱。本研究表明，中藥組和順鉑組IgG、IgM濃度均較模型組降低，并且給予參葵湯的模型大鼠IgG、IgM濃度與給予順鉑的模型大鼠相比也有明顯的降低，表明參葵湯能夠有效的提高機體的免疫功能。CD4+為輔助T細(xì)胞主要表面標(biāo)志，CD8+是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的主要表面標(biāo)記物質(zhì)。人機體內(nèi)通過不同的T淋巴細(xì)胞相互作用，以維持機體正常免疫功能。但隨著機體發(fā)生病理變化，CD4+和CD8+及其比值均會發(fā)生相應(yīng)的變化。本實驗中，模型大鼠由于接種了卵巢癌細(xì)胞，其免疫功能發(fā)生紊亂，給予參葵湯和順鉑腹腔灌注后使得CD4+百分率明顯升高，CD8+百分率明顯降低，CD4+/CD8+明顯升高，同時中藥組較順鉑組CD4+百分率明顯升高，CD8+百分率明顯降低，CD4+/CD8+明顯升高，表明參葵湯能夠明顯改善機體免疫功能降低，提高模型大鼠免疫功能的作用。