普通PCR技術(shù)和高靈敏HBV-DNA技術(shù)檢測(cè)乙肝病毒DNA的研究

鄔俊勇，張小蓮，江光榮，揭羽青，潘金平，歐陽(yáng)致成

（1.宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 宜春 336000；2.宜春市人民醫(yī)院輸血科，江西 宜春 336000；3.宜春市人民醫(yī)院肝病科，江西 宜春 336000）

慢性乙型肝炎也叫乙肝，是指乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）檢測(cè)陽(yáng)性，是臨床上常見的傳染性疾病，可通過血液和唾液傳播。主要臨床表現(xiàn)為惡心、乏力、腹脹和肝區(qū)疼痛等[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)大約有1億的人為乙肝病毒攜帶者，兩千萬慢性乙型肝炎患者，是我國(guó)社會(huì)負(fù)擔(dān)最大的疾病之一[3-4]。目前，臨床上對(duì)乙肝疾病的檢測(cè)主要是乙肝病毒血清標(biāo)志物（HBV-M）檢測(cè)，反應(yīng)的是人體對(duì)乙肝病的免疫狀態(tài)，以不同血清學(xué)模式代表不同的意義[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的興起，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和高靈敏HBV-DNA技術(shù)在乙肝病毒檢測(cè)上獲得了廣泛的應(yīng)用[6-7]。本研究以臨床收治43例肝炎患者為研究對(duì)象，采用普通PCR進(jìn)行定性檢測(cè)和高靈敏HBV-DNA技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)，探討兩種技術(shù)在乙肝病毒檢測(cè)上的應(yīng)用價(jià)值，以方便知道臨床診斷、用藥和預(yù)后判斷。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 以2016年1月～2017年8月宜春市人民醫(yī)院收治的43例肝炎患者為研究對(duì)象。Spectra Max M5e多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司）]，JY-96G梯度基因擴(kuò)增儀(武漢華科達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，DA7600全自動(dòng)熒光檢測(cè)系統(tǒng)(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)。乙肝兩對(duì)半抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)。乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（廣州達(dá)安基因股份有限公司），乙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒（廣州達(dá)安基因股份有限公司）。

1.2 方法 乙肝病毒血清標(biāo)志物檢測(cè)：ELISA檢測(cè)過程嚴(yán)格按照乙肝兩對(duì)半抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒說明書進(jìn)行，使用Spectra Max M5e多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)和結(jié)果判定。

普通PCR檢測(cè)：按照乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，40～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。使用JY-96G梯度基因擴(kuò)增儀進(jìn)行基因擴(kuò)增，電泳檢測(cè)。

高靈敏HBV-DNA檢測(cè)：嚴(yán)格按照乙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，高靈敏乙肝HBV-DNA技術(shù)：采用通用硅基捕獲技術(shù)，在Cobas Amp-liPrep儀器上進(jìn)行自動(dòng)化樣品制備，轉(zhuǎn)移至COBAS Taqman48儀器，使用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)自動(dòng)擴(kuò)增并檢測(cè)。若樣品的C＜20,則該樣品的HBV濃度＜20IU/ml，若樣品的20≤C≤1.70E+008,則該樣品的HBV-DNA濃度=CIU/ml，當(dāng)結(jié)果大于1.70E+008IU/ml，表示高于最高檢測(cè)上限需稀釋后再次進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo) 以血清標(biāo)志物組合為考察指標(biāo)，對(duì)普通PCR和高靈敏PCR技術(shù)的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種技術(shù)的陽(yáng)性率比較 使用普通PCR技術(shù)和高靈敏PCR技術(shù)對(duì)43份肝炎患者的血清進(jìn)行乙肝病毒檢測(cè)，從檢測(cè)結(jié)果上看，普通PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率是0，高靈敏PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率是46.5%，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.24，P=0.034＜0.05），見表1。

表1 普通PCR和高靈敏PCR檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 Comparison of detection results of common PCR and high sensitive PCR

2.2 兩種檢測(cè)方法與血清標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果的比較 在血清標(biāo)志物檢測(cè)的15例“大三陽(yáng)”血清樣本中，普通PCR僅檢測(cè)出0例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0，高靈敏PCR檢測(cè)出10例陽(yáng)性，陽(yáng)性率66.67%，陽(yáng)性率對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.24，P=0.143＜0.05）；13例“小三陽(yáng)”血清樣本中，普通PCR僅檢測(cè)出0例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0%，高靈敏PCR檢測(cè)出7例陽(yáng)性，陽(yáng)性率53.85%，陽(yáng)性率對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.12，P=0.157＜0.05）；8例“小二陽(yáng)”血清樣本中，普通PCR僅檢測(cè)出0例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0%，高靈敏PCR檢測(cè)出3例陽(yáng)性，陽(yáng)性率37.5%，陽(yáng)性率對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.34，P=0.017＜0.05），見表2。

表2 兩種PCR檢測(cè)方法與血清標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果的比較Table 2 Comparison of two PCR detection methods with serum marker detection results

3 討論

乙肝病毒血清標(biāo)志物檢測(cè)是臨床上最常用的檢測(cè)方法。感染病毒時(shí)出現(xiàn)多種免疫應(yīng)答過程，得到不同的結(jié)果組合，該檢測(cè)雖能定性檢測(cè)到乙肝表面抗原、表面抗體、e抗原、e抗體和核心抗體的陰性或者陽(yáng)性結(jié)果，但并不能反應(yīng)出病毒在患者體內(nèi)的復(fù)制情況和傳染程度，無法指導(dǎo)臨床用藥和治療[8]。隨著分子生物學(xué)的興起，熒光定量PCR技術(shù)在乙肝病毒檢測(cè)過程中，可以直接反映出病毒的復(fù)制情況，具有快讀、特意、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，在臨床上獲得廣泛的關(guān)注。姚兆基[9]采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)76例乙肝患者的結(jié)果可見，大三陽(yáng)的檢出率最高，達(dá)到96.15%，顯著高于其他的組合，作者通過研究認(rèn)為，RT-PCR和ELISA法聯(lián)合可提高臨床的診斷率，為藥物治療提供參考。本研究中，普通PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率是0%，高靈敏PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率是46.5%，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；在血清標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果組合中，高靈敏PCR檢測(cè)的“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”和“小二陽(yáng)”的陽(yáng)性率都顯著高于普通PCR的檢測(cè)結(jié)果，這和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[10]。

綜上所述，與普通PCR相比，高靈敏PCR法可以檢測(cè)出患者的免疫狀況和病毒傳染性的強(qiáng)弱，而且靈敏性更高，可用于指導(dǎo)臨床患者用藥和判斷預(yù)后。