復(fù)凝聚法制備藥物微膠囊及細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

方 芳， 周 峻， 湯谷平

(浙江大學(xué) 化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，杭州 310058)

0 引 言

如何延長藥物的釋藥時(shí)間和藥效持續(xù)時(shí)間成為制藥應(yīng)用研究的關(guān)鍵問題[1]。而微膠囊化可以改善被包埋物質(zhì)的物理性質(zhì)，提高其穩(wěn)定性，具有控制藥物釋放速度、保護(hù)芯材活性成分免受環(huán)境影響[2]，改善被包埋物質(zhì)的反應(yīng)活性、耐久性、壓敏性、熱敏性和光敏性，屏蔽氣味、降低物質(zhì)毒性等[3]。微膠囊是指用高分子材料把分散的固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)物質(zhì)包埋成微小封閉容器，微膠囊的粒徑通常在2～1 000 μm[4-5]，其外形一般呈球形[6]。

本文以卡培他濱為芯材，明膠、阿拉伯膠為壁材，采用復(fù)凝聚法制備微膠囊，通過研究各工藝參數(shù)對(duì)微膠囊制備的影響，確定最佳制備條件，并通過四氮唑藍(lán)比色實(shí)驗(yàn)(MTT法)比較藥物和微膠囊的細(xì)胞毒性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：明膠，阿拉伯膠,甲醛，醋酸，氫氧化鈉，卡培他濱，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT，5 mg/mL)，二甲基亞砜(DMSO)，以上試劑均為分析純；DMEN培養(yǎng)液，新生小牛血清，以上試劑為生物試劑，用于細(xì)胞培養(yǎng)，所有試劑均為上海阿拉丁生化科技股份有限公司購置的。

儀器：ECLIPSE Ti倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)，UH5300紫外分光光度計(jì)(日本HITACHI)，Mastersizer 2000粒徑分布儀(英國Malvern)，BCTB S25 BASIC磁力攪拌器(德國IKA)，MIKRO22R高速離心機(jī)(德國Hetich)，371型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo)，BIO-RAD 680酶標(biāo)儀(美國Thermo，配570 nm濾光片)，MS3微量振蕩器(德國IKA)，JB-CJ-2FXS超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶)。

1.2 微膠囊的制備

取一定量的阿拉伯膠水溶液(5%,重量體積比)和一定量的藥物，置于恒定的水浴中，磁力攪拌1 h后加入一定量的明膠溶液(5%,重量體積比)，繼續(xù)攪拌1.5 h。用醋酸調(diào)pH至4.2左右，繼續(xù)攪拌1.5 h。攪拌結(jié)束后，將上述溶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入1 mL甲醛溶液，進(jìn)行微膠囊的固化，滴加結(jié)束后繼續(xù)常溫?cái)嚢?.5 h。離心分離后，沉淀即微膠囊，用蒸餾水分散后用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.3 微膠囊形態(tài)學(xué)鑒定

取成囊后的溶液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片后在倒置熒光顯微鏡下觀察其外部形貌。

1.4 微膠囊包封率的測(cè)定

(1) 測(cè)定波長的選擇。取卡培他濱標(biāo)準(zhǔn)液，以蒸餾水作參比，用紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行波長掃描，最終定為304 nm。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的制定。準(zhǔn)確稱取卡培他濱10 mg，用蒸餾水定溶至100 mL，配成0.1 mg/mL的溶液。移取0.1 mg/mL卡培他濱溶液10 mL，定容至100 mL，作為配置標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取上述溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL定容至50mL，以蒸餾水為參比，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在304 nm處的吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

(3) 包封率的測(cè)定。將離心分離后的上清液用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)量，確定未被包埋的卡培他濱的藥量，

1.5 微膠囊粒徑分布的測(cè)定

在不同的攪拌速度下制得的藥物膠囊，用粒徑分布儀對(duì)膠囊的粒徑分布進(jìn)行測(cè)量。使用去離子水將微膠囊制成懸浮液在激光粒度儀上進(jìn)行測(cè)試。

1.6 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將C6細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育16 h。

配制不同濃度的含有卡培他濱母液和無血清培養(yǎng)液的混合溶液，總體積均700 μL，濃度梯度為12.5、25、50、100、125 μg/mL。將混合溶液加入到培養(yǎng)板的孔中(加之前吸去原有培養(yǎng)液)，每孔液體的總體積在200 μL(注意每種濃度都為三復(fù)孔，另外需要0%MTT溶液三復(fù)孔)。孵育4 h后，吸去溶液，每孔加入90 μL無血清培養(yǎng)液和10 μL的5 mg/mL MTT溶液，37 ℃孵育2～3 h。翻板法棄去液體，每孔加入100 μLDMSO，在震蕩器上震蕩10 min。在酶標(biāo)儀上用570 nm波長測(cè)吸光度(OD)值。細(xì)胞活力的計(jì)算式：

向離心后的微球加入1 mL去離子水混合均勻制成微球制劑，然后分別制成12.5、25、50、100、125 μg/mL溶液。加無血清培養(yǎng)液制成總體積為700 μL的制劑溶液，按上述方法進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 芯壁比的確定

芯材與壁材的比例(芯壁比)能夠顯著影響所形成微膠囊的粒徑大小和形態(tài)特征[14]。圖1是不同芯壁比時(shí)制備的卡培他濱微膠囊的倒置熒光顯微鏡外部形貌。

(a) 芯壁比=1.0∶1.0

(b) 芯壁比=1.00∶1.25

(c) 芯壁比=1.0∶1.5

從圖1可以看出，隨著芯壁比的減少，微膠囊平均粒徑逐漸增大。這是由于在微膠囊形成的過程中，提高壁材(阿拉伯膠和明膠)用量可以增加囊壁的厚度，導(dǎo)致粒徑增大，同時(shí)有利于改善微膠囊對(duì)芯材的保護(hù)性和緩釋性，為此確定的最佳芯壁比微1.0∶1.5。

2.2 pH值

復(fù)凝聚的pH值對(duì)微膠囊的形成有著重要的影響，本研究通過改變pH值觀察微膠囊形成的現(xiàn)象，討論pH值對(duì)微膠囊制備的影響。pH值為4.0時(shí)，固化后有少量微膠囊形成，離心后分層不明顯；pH值為4.2時(shí)，固化后靜置，有較多微膠囊形成，離心后分層明顯；pH值為4.5時(shí)，固化后溶液透明，離心后不分層，基本無微膠囊形成，具體對(duì)比見圖2，由此確定最佳pH值為4.2。

pH 4.0pH 4.2pH 4.5

圖2 不同pH值條件下制得的微膠囊形態(tài)對(duì)比

2.3 溫 度

在保持其他條件不變的情況下，研究溫度對(duì)微膠囊制備的影響，具體結(jié)果見圖3。由于低溫下明膠和阿拉伯膠的混合溶液黏度較大，成膜的反應(yīng)可能不夠充分，不利于復(fù)凝聚的發(fā)生，而隨著復(fù)凝聚溫度的提高，明膠和阿拉伯膠的混合黏度降低，有助于提高帶電荷電解質(zhì)的流動(dòng)性，兩者之間的復(fù)凝聚反應(yīng)會(huì)更充分。但溫度過高，明膠蛋白質(zhì)易于水解，并且產(chǎn)物的分子運(yùn)

圖3 復(fù)凝聚溫度與包封率的關(guān)系

動(dòng)加快，使得明膠和阿拉伯膠不能聚集在藥物表面形成囊體，導(dǎo)致芯材包封率過低。由此可得，合理的復(fù)凝聚溫度為55 ℃。

2.4 攪拌速度

在不同的攪拌速度下，制備的微膠囊粒徑用粒徑分布儀進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果見圖4。從圖中可知，當(dāng)攪拌速率為800 r/min時(shí)，微膠囊的粒徑d0.5為14.38 μm；攪拌速率為1 200 r/min時(shí)，微膠囊的粒徑d0.5為7.38 μm；攪拌速率為1 600 r/min時(shí)，微膠囊的粒徑d0.5為2.45 μm。由此可見，隨著攪拌速率的增加，微膠囊的粒徑隨之變小。

圖4 不同攪拌速率下微膠囊的粒徑分布圖

2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

圖5是MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在與細(xì)胞作用相同時(shí)間下，藥物對(duì)細(xì)胞的毒性更大，說明微膠囊對(duì)細(xì)胞具有緩釋的潛能。因?yàn)槲⒛z囊通過囊壁對(duì)囊芯物進(jìn)行包裹，既可以實(shí)現(xiàn)有效成分的保護(hù)及緩慢釋放[15]，降低了藥物的毒性。

圖5 藥物濃度與細(xì)胞存活率關(guān)系圖

3 結(jié) 語

實(shí)驗(yàn)采用復(fù)凝聚法制備微膠囊，以卡培他濱為芯材，明膠、阿拉伯膠為壁材，通過對(duì)不同工藝條件的研究，得出其最佳制備條件為：芯壁比1.0∶1.5，復(fù)凝聚溫度為55 ℃，pH 4.2，攪拌速率為1 600 r/min。通過對(duì)比藥物和微膠囊的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)可知，微膠囊化對(duì)藥物具有緩釋作用，可以提高藥物的藥效。該實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡單，操作容易，具有一定的創(chuàng)新性和實(shí)用性，易于鍛煉學(xué)生的科研能力。