PTEN、TRA2B在人低分化胃腺癌中的表達(dá)及其意義

靳俊峰 劉銀花 歐小波 阮媛 王海青 陳燕玲 吳秀香 易華

1遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)（廣東珠海 519041）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（廣州 510006）

胃癌是消化系統(tǒng)的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，也是引起癌癥性相關(guān)死亡的第三大癌癥類型。低分化胃癌對(duì)人體的健康危害尤其嚴(yán)重。許多的研究表明，腫瘤與基因突變有關(guān)，突變的基因是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。促癌基因（Transformer?2 protein homolog beta，TRA2B）屬于SR相關(guān)蛋白家族，富含絲氨酸/精氨酸，通過(guò)參與前體mRNA的選擇性剪接，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的，進(jìn)而影響疾病及某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［1］。抑癌基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chro?mosome ten，PTEN）是P53基因外最重要的腫瘤抑制基因之一，參與細(xì)胞周期和多種信號(hào)途徑的調(diào)控，在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、血管生成等方面發(fā)揮重要作用，與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。但PTEN在低分化胃癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中作用尚不清楚。本研究通過(guò)研究低分化胃癌組織中PTEN和TRA2B的表達(dá)情況，為進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制、診斷及預(yù)后評(píng)估提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2013-2016年低分化胃癌患者手術(shù)存檔蠟塊9例（來(lái)自遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院病理科），病理標(biāo)本均為胃癌組織及同一患者的癌旁正常組織，病理診斷結(jié)果經(jīng)本院病理科2名以上病理醫(yī)師確認(rèn)均為低分化腺癌。所有患者均有明確的手術(shù)時(shí)間，術(shù)前均未接受化療和放療等抗癌治療，其中男6例，女3例，年齡40～68歲，中位年齡54歲。臨床分期參照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）與美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Can?cer，AJCC）TNM分期系統(tǒng)（第七版），Ⅰ-Ⅱ期7例，Ⅲ-Ⅳ期2例。Dukes分期，證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例，無(wú)轉(zhuǎn)移3例。

1.2 試劑及儀器 Ⅰ兔抗人PTEN多克隆抗體（bs?0748R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、兔抗人TRA2B多克隆抗體（ab50846，abcam公司），羊抗兔IgG（SP?0022，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、羊抗兔IgG?FITC（SA1064，武漢博士德生物技術(shù)有限公司），核標(biāo)記物 Propidium iodide（PI，P4170，Sigma公司），DAB顯色試劑盒（C02?04001，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）（武漢博士德生物技術(shù)有限公司），日本產(chǎn)IX71奧林巴斯倒置光顯微鏡。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用SP兩步法染色（參照Invitrogen公司提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色），石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；3%H2O2室溫孵育10 min；0.01 mmol/L PBS緩沖液（pH＝7.4，下同）沖洗3次×5 min；置pH＝6.0的檸檬酸緩沖液煮沸3 min，中火10 min，取出自然冷卻至室溫；PBS水沖洗3次×5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min；PBS緩沖液沖洗3次×3 min；滴加稀釋度1∶200的PTEN多克隆抗體稀釋度1∶200，4℃冰箱過(guò)夜；PBS沖洗3次×5 min，順序滴加生物素化Ⅱ抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色3～5 min；流水沖洗5 min；蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化；自來(lái)水沖洗5 min；常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。根據(jù)Ⅰ抗試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)選用以PTEN陽(yáng)性的標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。

PTEN結(jié)果判定：棕黃色及棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定時(shí)采用雙盲法，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師在200倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜25%為陰性（-）、≥25%為陽(yáng)性（+）。

1.4 免疫熒光染色及結(jié)果判定 采用SP兩步法染色（參照Invitrogen公司提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫熒光染色），石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；3%H2O2室溫孵育10 min；0.01 mmol/L PBS緩沖液（pH＝7.4，下同）沖洗 3次×5 min；置pH＝6.0的檸檬酸緩沖液煮沸3 min，中火10 min，取出自然冷卻至室溫；PBS水沖洗3次×5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min；PBS緩沖液沖洗3次×3 min；滴加稀釋度1∶200的TRA2B多克隆抗體，4℃冰箱過(guò)夜；PBS沖洗3次×5 min，滴加Ⅱ抗羊抗兔FITC（1∶100），室溫孵育60 min；PBS沖洗3次× 5 min；滴加PI染核1 min，PBS沖洗3次× 5 min；甘油封片。

標(biāo)本組織中出現(xiàn)綠色熒光視為陽(yáng)性結(jié)果，PI染核呈紅色。根據(jù)Ⅰ抗試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)選用以TRA2B陽(yáng)性的標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。定性資料用率表示，差異性檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN在低分化胃癌組織中的表達(dá) PTEN蛋白主要定位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞核，陽(yáng)性產(chǎn)物染色呈棕黃色或棕褐色。PTEN在低分化胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)弱于正常胃組織（圖1）。低分化胃癌組織中PTEN陽(yáng)性率為77.8%，低于癌旁組織的88.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 PTEN在正常胃組織及低分化胃癌組織中的表達(dá)Fig.1 The expression of PTEN in normal stomach tissue and low differentiated gastric cancer tissue

表1 PTEN在正常胃組織及低分化胃癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率Tab.1 The positive rate of PTEN in normal stomach tissue and low differentiated gastric cancer tissue

2.2 TRA2B在低分化胃癌組織中的表達(dá) TRA2B蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。TRA2B在低分化胃癌細(xì)胞核中表達(dá)明顯，但在正常胃組織中表達(dá)較弱（圖2）。低分化胃癌組織中TRA2B陽(yáng)性率為66.7%，正常胃組織中TRA2B陽(yáng)性率為22.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

圖2 TRA2B在正常胃組織及低分化胃癌組織中的表達(dá)Fig.2 The expression of TRA2B in normal stomach tissue and low differentiated gastric cancer tissue

表2 TRA2B在正常胃組織及低分化胃癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率Tab.2 The positive rate of TRA2B in normal stomach tissue and low differentiated gastric cancer tissue

2.3 低分化胃癌組織中PTEN蛋白表達(dá)水平、TRA2B蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 對(duì)于低分化胃癌中PTEN和TRA2B蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別、TNM分期之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但PTEN和TRA2B蛋白的表達(dá)與低分化胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性（P＜0.05）。

2.4 胃癌中PTEN和TRA2B表達(dá)相關(guān)性分析 胃癌組織中PTEN和TRA2B表達(dá)不具有相關(guān)性（P=1）。

表2 PTEN、TRA2B蛋白表達(dá)與低分化胃癌臨床特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between the expression of PTEN and TRA2B protein and low differentiated gastric cancer clinic pathologic feature

3 討論

胃癌是一種由多步驟引起、多基因參與的惡性腫瘤，腺癌是其主要的病理學(xué)類型，其中中低分化腺癌對(duì)人類健康危害尤其嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因作為重要的抑癌基因之一，在胃中低分化腺癌中表達(dá)與正常胃組織相比明顯降低，其表達(dá)在年齡、性別、TNM分期方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，且統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示PTEN基因可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。既往的研究表明，胃癌組織中PTEN蛋白的表達(dá)存在缺乏或者異常，可能與胃癌的發(fā)生及生物學(xué)行為有關(guān)［5］。本研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果相一致，胃低分化腺癌PTEN蛋白表達(dá)明顯低于正常胃組織，表明其與胃癌的發(fā)生有一定的關(guān)系。

表3 低分化胃癌組織中PTEN和TRA2B蛋白的關(guān)系Tab.3 The relationship between the expression of PTEN and TRA2B protein in low differentiated gastric cancer

TRA2B（又稱SFRS10）是一個(gè) SR（Serine/Argi?nine?rich proteins）相關(guān)蛋白，定位于人類3號(hào)染色體長(zhǎng)臂，編碼Tra2β蛋白，其N端和C端富含高度磷酸化的精氨酸/絲氨酸富含結(jié)構(gòu)域（arginine/ser?ine?rich domain，RS結(jié)構(gòu)域），通過(guò)與RRM結(jié)構(gòu)域的特異性識(shí)別，將剪接因子聚集到前體mRNA的特異性剪接位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)前體mRNA的選擇性剪接［6-9］。既往的研究表明，TRA2B可表達(dá)于正常人體組織，也參與了很多疾病的發(fā)生和發(fā)展，在宮頸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌［10-12］等多種惡性腫瘤中也呈現(xiàn)高表達(dá)，但在胃中低分化腺癌中的表達(dá)及臨床意義研究不多，相關(guān)問(wèn)題尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，TRA2B在胃低分化腺癌中表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，遠(yuǎn)高于正常胃組織。TRA2B蛋白表達(dá)與年齡、性別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異，而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

PTEN基因是人體內(nèi)除了P53基因外，最廣泛存在于人體的抑癌基因，在人體中發(fā)揮著重要的作用，參與腫瘤的發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移［13-14］等多個(gè)過(guò)程，其調(diào)節(jié)胃癌的機(jī)制非常復(fù)雜［15］，而TRA2B基因是癌基因，既往的研究也表明，參與了多種癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移［10-12］，但是關(guān)于二者之間的相關(guān)性研究卻鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃低分化腺癌中，PTEN和TRA2B的表達(dá)有相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈負(fù)相關(guān)，表明二者在胃低分化癌中可能存在協(xié)同關(guān)系。

本研究樣本量較少，對(duì)PTEN和TRA2B二者的關(guān)系研究不夠深入等不足，并且對(duì)于PTEN和TRA2B在低分化胃癌發(fā)展轉(zhuǎn)移中的具體作用機(jī)制尚不夠明確，仍需通過(guò)進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明具體的分子作用機(jī)制。