甘草酸二銨對(duì)百草枯刺激大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌TGF?β1的影響

向?yàn)r 方辰 周志兵 張劍鋒

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)教研室（南寧530007）

前期研究已經(jīng)證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF?β1）在百草枯導(dǎo)致的急性肺損傷和肺纖維化中起到關(guān)鍵作用，但其作用機(jī)制尚不明確。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AECⅡ）是百草枯致肺損傷的主要靶細(xì)胞［1］，AECⅡ在此過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、線粒體破壞等表現(xiàn)［2］。AECⅡ也是TGF?β1分泌的重要來(lái)源［3］。我們同期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，藥物甘草酸二銨對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用，并能抑制急性肺損傷時(shí)TGF?β1的過(guò)度表達(dá)［4］，并因此推測(cè)：甘草酸二銨對(duì)百草枯中毒時(shí)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。但甘草酸二銨抑制肺損傷時(shí)TGF?β1表達(dá)是否與AECⅡ相關(guān)仍未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，構(gòu)建甘草酸二銨干預(yù)百草枯刺激大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷模型，進(jìn)一步觀察甘草酸二銨對(duì)百草枯刺激大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌TGF?β1的影響，以期了解其具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（上海滬震實(shí)業(yè)公司），RPMI Medium 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），米非司酮、MTT試劑（美國(guó)Sigma公司），青鏈霉素混合液（100×）（北京索萊寶科技有限公司），百草枯（美國(guó)Sigma公司），甘草酸二銨（江蘇正大天晴制藥有限公司），總RNA抽取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Roche公司），大鼠TGF?β1 ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Bio?systems StepOne公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek Instru?ments公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 按PQ濃度將AECⅡ分為不同濃度的培養(yǎng)組：200、400、600、800、1 000、1 500、2 000 μmol/L組，了解IC50的PQ濃度。確立以1 000 μmol/L PQ刺激AECⅡ，再重新于96孔板中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0 mg/mL DG培養(yǎng)2 h，再以對(duì)應(yīng)濃度的DG+1 000 μmol/L PQ培養(yǎng)24 h。了解干預(yù)PQ刺激下AECⅡ生存率最高的DG濃度。最后進(jìn)行DG干預(yù)PQ刺激AECⅡ分泌TGF?β1實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組，未干預(yù)培養(yǎng)24 h；PQ 組，以含1 000 μmol/L PQ的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；DG組，先以含0.6 mg/mL DG的培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，再以0.6 mg/mL DG+1 000 μmol/L PQ的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 不同PQ濃度組和不同DG濃度組細(xì)胞的存活率 采用MTT比色法。用多功能熒光發(fā)光儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的吸光度（A）值，計(jì)算存活率。存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.3.2 AECⅡ倒置顯微鏡下觀察 培養(yǎng)24 h后使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)改變、生長(zhǎng)情況。

1.3.3 TGF?β1濃度測(cè)定 取細(xì)胞培養(yǎng)物上清，用ELISA試劑盒按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TGF?β1的濃度。

1.3.4 TGF?β1 mRNA水平測(cè)定 用TriPure法提取大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行RT?PCR。以β?actin作為內(nèi)參照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。β?actin上游引物序列 5′?CTATCGGCAATGAGCGGTTCC?3′，下游引物 5′?TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG?3；TGF?β1上游引物序列5′?CATTGCTGTCCCGTG?CAGA ?3′，下 游 引 物 序 5′?AGGTAACGCCAG?GAATTGT?TGCTA?3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。PCR后，用ABI 7500軟件分析基因擴(kuò)增情況，得到相應(yīng)Ct值，基因相對(duì)表達(dá)量采用2?△△Ct方法計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間相互比較采用LSD?t檢驗(yàn)作兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PQ對(duì)AECⅡ增殖作用的影響 在含濃度為200、400、600、800、1 000、1 500 和2 000 μmol/L的PQ培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，隨著PQ濃度增加而生存率降低。IC50的PQ濃度為920.87 μmol/L，因此在本次實(shí)驗(yàn)中，以1 000 μmol/L PQ作為誘導(dǎo)濃度。見(jiàn)圖1。

圖1 不同PQ濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.1 The of viability of AECⅡcultured with varied concentrations of PQ

2.2 DG對(duì)PQ刺激下AECⅡ增殖作用的影響在1 000 μmol/L PQ刺激下，以0 、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0濃度DG干預(yù)AECⅡ，以0.6 mg/mL DG干預(yù)24 h生存率最高。因此，在本次實(shí)驗(yàn)中，以0.6 mg/mL DG作為干預(yù)濃度。見(jiàn)圖2。

2.3 細(xì)胞倒置顯微鏡下觀察 NS組（圖3A）細(xì)胞排列緊密、貼壁良好。與NS組比較，PQ組（圖3B）中細(xì)胞稀疏，細(xì)胞膜出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。而且細(xì)胞貼壁不良，有脫落凋亡。DG組（圖3C）中細(xì)胞亦出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞貼壁不良，脫落凋亡，但與PQ組比較細(xì)胞損傷明顯減輕。

2.4 AECⅡ培養(yǎng)物上清TGF?β1的變化 與對(duì)照組比較，PQ組TGF?β1蛋白濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PQ組比較，DG組TGF-β1濃度明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。與對(duì)照組比較，PQ組TGF?β1 mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PQ組比較，DG組TGF?β1 mRNA表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖2 甘草酸二銨對(duì)百草枯（1 000 μmol/L）刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖作用的影響Fig.2 Effects of DG on the proliferation of AECⅡstimulated by paraquat（1 000 μmol/L）

3 討論

圖3 細(xì)胞倒置顯微鏡下觀察（20×）Fig.3 Observation of cell morphology by inverted microscope

圖4 各組細(xì)胞TGF?β1蛋白表達(dá)（n=3）Fig.4 The levels of TGF?β1 in cell culture supernatant

圖5 各組細(xì)胞的TGF?β1 mRNA表達(dá)（n=3）Fig.5 The expressions of TGF?β1 mRNA in cell culture supernatant

百草枯中毒對(duì)人體各個(gè)器官組織都有損傷，以肺組織的損傷最為嚴(yán)重。百草枯中毒機(jī)制可能與形成大量氧自由基使生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化，造成DNA損傷；以及激活免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子、趨化因子、早期生長(zhǎng)因子等多種生物學(xué)效應(yīng)，造成組織炎癥反應(yīng)及肺纖維化［5］。百草枯對(duì)肺的作用可能與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞存在聚胺類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)［1］，故PQ進(jìn)入人體后在肺組織中大量聚集。PQ中毒18 h后，AECⅡ開(kāi)始出現(xiàn)水腫，24 h后，AECⅡ中的線粒體明顯水腫、破裂［6］，72～ 96 h后，肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死［7］。因此，AECⅡ損傷是百草枯性肺損傷的關(guān)鍵啟動(dòng)環(huán)節(jié)，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的進(jìn)一步損傷導(dǎo)致的肺臟自身修復(fù)功能障礙可能是導(dǎo)致急性百草枯中毒肺損傷進(jìn)入不可逆的階段的重要原因。逆轉(zhuǎn)AECⅡ的細(xì)胞功能，將對(duì)治療百草枯性肺損傷具有極其重要的意義。甘草酸二銨在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與腎上腺皮質(zhì)激素具有相似性，也具有與糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素類(lèi)似的功能作用。甘草酸可影響糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體，從而影響機(jī)體類(lèi)固醇效應(yīng)。具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、護(hù)肝及抗腫瘤等功能，甘草酸亦可減輕肺部炎癥反應(yīng)。因此，DG在PQ誘導(dǎo)ALI的治療方面有著巨大潛力。但DG調(diào)控肺部炎癥損傷的具體機(jī)制尚未明確。

本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建甘草酸二銨干預(yù)百草枯損傷大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞模型中，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著PQ濃度的升高，AECⅡ的損傷增強(qiáng)。IC50的PQ濃度為920.87 μmol/L。因此，在本次細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，以1 000 μmol/L作為誘導(dǎo)濃度。在1 000 μmol/L PQ誘導(dǎo)下，以0.6 mg/mL DG干預(yù)AECⅡ24 h生存率最高，以0.6 mg/mL DG作為干預(yù)濃度。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AECⅡ在含PQ的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，TGF?β1分泌水平明顯升高。同時(shí)甘草酸二銨減少PQ誘導(dǎo)下AECⅡ中TGF?β1的分泌水平，證實(shí)甘草酸二銨可直接影響AECⅡ的TGF?β1表達(dá)。

TGF?β1可促使肺成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖、分化，誘導(dǎo)膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)在肺內(nèi)過(guò)度積聚［8］，啟動(dòng)肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展，在肺纖維化的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在PQ中毒的肺組織中，隨著TGF?β1的過(guò)度表達(dá)，肺間質(zhì)纖維化程度也不斷加深，同時(shí)PQ還能刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，最終造成不可逆的肺功能衰竭［9］。TGF?β還與其他參與肺纖維化形成的細(xì)胞因子之間有著緊密聯(lián)系。TGF?β1可誘導(dǎo)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）的過(guò)度表達(dá)，而CTGF在細(xì)胞外基質(zhì)沉積過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［9-10］。有研究表明，PQ中毒能夠使MRC?5細(xì)胞TGF?β1/Smad信號(hào)通路活化，調(diào)節(jié)下游基因CTGF的表達(dá)，繼而介導(dǎo)TGF?β1的促纖維化作用［11］。

甘草酸二銨通過(guò)抑制AECⅡ中TGF?β1的過(guò)度表達(dá)可能有如下途徑：（1）通過(guò)減輕百草枯致AECⅡ損傷時(shí)ROS的過(guò)度產(chǎn)生，而進(jìn)一步減少TGF?β1的過(guò)度表達(dá)；百草枯致肺損傷時(shí)，所產(chǎn)生的ROS可刺激前纖維化因子TGF?β1的產(chǎn)生［12］。有研究表明，烏司他丁可減輕百草枯致AECⅡ損傷中ROS的過(guò)度產(chǎn)生［13］，甘草酸二銨也有可能通過(guò)該途徑減輕TGF?β1的過(guò)度表達(dá)。（2）通過(guò)抑制百草枯致AECⅡ損傷時(shí)NF?κB的過(guò)度表達(dá)，從而降低AECⅡ中TGF?β1的過(guò)度分泌。在百草枯導(dǎo)致肺纖維化的過(guò)程中，NF?κB的活化可引起下游目標(biāo)基因TGF?β1轉(zhuǎn)錄的激活［14］，有研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸可以選擇性抑制Ca2+通道活性而抑制NF?κB對(duì)其靶元件的結(jié)合活性，降低NF?κB的表達(dá)［15］，以此減輕TGF?β1的過(guò)度表達(dá)。（3）通過(guò)上調(diào)糖皮質(zhì)激素受體（GR）的表達(dá)，促進(jìn)糖皮質(zhì)激素作用，進(jìn)而降低百草枯致AECⅡ中TGF?β1的表達(dá)。課題前期實(shí)驗(yàn)有證明，甘草酸二銨可上調(diào)大鼠急性肺損傷的GR表達(dá)水平［16］。DG通過(guò)上調(diào)GR間接影響TGF?β1的表達(dá)水平。

綜上所述，本文通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)體外研究觀察了DG干預(yù)對(duì)AECⅡ的損傷和分泌TGF?β1功能的影響，在百草枯致肺損傷早期，AECⅡ分泌的前纖維化因子TGF?β1參與了肺損傷及肺纖維化的病程；甘草酸二銨能通過(guò)抑制AECⅡ的TGF?β1過(guò)度表達(dá)，從而減輕肺組織的損傷，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。體外研究的局限性在于未能綜合考慮各細(xì)胞和組織間的綜合作用，還需更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究甘草酸二銨對(duì)百草枯致急性肺損傷中肺內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等和各炎癥因子及其相關(guān)信號(hào)通路的作用。