CXCR4 siRNA通過抑制STAT3信號通路抑制肺癌細(xì)胞活力

郭偉峰， 何約明， 莊錫彬， 黃 弘， 徐 萌， 黃鴻波， 林藝堅(jiān)， 寇美麗

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 福建 泉州 362000)

肺癌是一種惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率都很高，嚴(yán)重威脅人類的生命和健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國2015年約有429.2萬例新發(fā)病例和281.4萬例死亡病例，其中肺癌位于腫瘤死亡原因的第一位[1]。由于環(huán)境的惡化和人口的老齡化原因等，導(dǎo)致中國肺癌的發(fā)病率和死亡率越來越高，據(jù)估計(jì)到2025年中國肺癌的患者將達(dá)到100萬左右[2]。目前肺癌的治療主要采取放、化療結(jié)合抗腫瘤藥物，但效果甚微，肺癌患者的5年生存率從12%僅上升為16%[3]。肺癌是一種多基因異常引起的惡性腫瘤，多種癌基因的異常表達(dá)及抑癌基因的失活等，導(dǎo)致正常細(xì)胞群的增殖、凋亡等生理過程異常，但其分子機(jī)制不完全清楚，成為亟需解決的問題之一。研究表明CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中呈過表達(dá)趨勢，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、周期和侵襲等多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]。本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾(RNA interference， RNAi)的方法干擾CXCR4基因表達(dá)，觀察敲減CXCR4基因表達(dá)對肺癌細(xì)胞活力和凋亡的影響，為在細(xì)胞水平抑制肺癌的發(fā)生、發(fā)展提供新的方法。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

人肺癌細(xì)胞系NCI-H292購自ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；CXCR4小干擾RNA(small interfe-ring RNA, siRNA；正義鏈為5’-CGUUCCUAUUGCAUUATT-3’，反義鏈為5’-UAAUGCAAUAGCAGGACAGTT-3’)由上海吉瑪有限公司合成； 蛋白裂解液購自Thermo；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自英杰生命技術(shù)有限公司；STAT3抑制劑NSC 74859和抗β-actin抗體購自Sigma；抗信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、p-STAT3、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cleaved caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶1[poly (ADP-ribose) polymerase 1, PARP1]抗體和辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記羊抗兔 II 抗均購自Cell Signaling Technology。流式細(xì)胞分析儀購自BD；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱和離心機(jī)均購自Thermo；垂直電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽購自Bio-Rad。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞NCI-H292培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入10%的FBS和雙抗，確保細(xì)胞培養(yǎng)過程中的無菌性，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d按1 ∶3的比例進(jìn)行傳代。選擇生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將NCI-H292細(xì)胞經(jīng)PBS緩沖液清洗后接種于24孔板上，每孔4×105個細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞的融合度達(dá)到80%左右時，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染從而獲得穩(wěn)定過表達(dá)目的基因的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白對照(control)組(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、陰性對照(negative)組(轉(zhuǎn)染無關(guān)序列RNA)和siRNA-CXCR4組(轉(zhuǎn)染siRNA-CXCR4)，轉(zhuǎn)染48 h后采用Western blot法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。

2.3CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活力 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，以每孔2×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，加入不含抗生素的培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)5個復(fù)孔。待細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL CCK-8溶液，置于酶標(biāo)儀上檢測450 nm波長處的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以2.5×105個細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞收集到離心管中，離心，加入預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌，逐滴加入75%的乙醇，調(diào)整細(xì)胞濃度，按照Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率。

2.5Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中STAT3、p-STAT3、cyclin D1、cleaved caspase-3和PARP1的蛋白水平 取1×106個細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，更換為無血清培養(yǎng)基，按上述分組處理細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的D-Hanks溶液和200 μg PMSF混合裂解液，混勻，置于冰上裂解30 min，4 ℃離心20 min，取上清，Bradford法測定蛋白濃度。清洗、安裝電泳槽的玻璃模具，制備10%的分離膠和5%堆積膠，插入梳子，避免氣泡產(chǎn)生。取50 μg蛋白樣品加入上樣孔，100 ℃加熱5 min，加入電泳緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80 V電泳30 min，然后調(diào)至120 V電泳120 min。切下分離膠，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，轉(zhuǎn)膜3～4 h，5%脫脂牛奶封閉1～2 h，加入1 ∶1 000稀釋的 I 抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4次，每次15 min，加入 II 抗，37 ℃孵育1～2 h，TBST清洗15 min×4次，將ECL顯色液加入濾膜上，暗室中孵育5 min，以β-actin為內(nèi)參照，凝膠成像系統(tǒng)中測定蛋白的灰度值。

2.6STAT3抑制劑對肺癌細(xì)胞的活力和凋亡的影響 根據(jù)何志勇等[6]的報道，文本采用50 μmol/L的NSC-74859作用于已轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞48 h，實(shí)驗(yàn)分為空白對照(control)組、siRNA-CXCR4組和抑制劑(inhibitor)組，根據(jù)上述方法，Western blot檢測細(xì)胞中p-STAT3蛋白的表達(dá)量，CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測細(xì)胞的活力和凋亡率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異使用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染效果的檢測

如圖1所示，各組間CXCR4蛋白表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與空白對照組相比，陰性對照組細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)量無明顯變化，而siRNA-CXCR4組細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

Figure 1. The protein expression of CXCR4 in transfected cells.Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group.

圖1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)量

2 敲減CXCR4基因表達(dá)后細(xì)胞活力的變化

如圖2所示，各組間細(xì)胞活力的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與空白對照組相比，陰性對照組細(xì)胞的活力無明顯變化，siRNA-CXCR4組細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05)。

3 敲減CXCR4基因表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示， 與空白對照組相比，陰性對照組細(xì)胞的凋亡率以及cleaved caspase-3和PARP1蛋白水平無明顯變化，siRNA-CXCR4組細(xì)胞的凋亡率及cleaved caspase-3和PARP1蛋白水平顯著增加(P<0.05)。

Figure 2. The effect ofCXCR4 gene expression knockdown on the viability of lung cancer cells. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group.

圖2敲減CXCR4基因表達(dá)對肺癌細(xì)胞活力的影響

4 敲減CXCR4基因表達(dá)后細(xì)胞中STAT3、p-STAT3和cyclin D1蛋白水平的變化

如圖4所示，各組間蛋白水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與空白對照組相比，陰性對照組細(xì)胞中STAT3、p-STAT3和cyclin D1的蛋白水平無明顯變化，siRNA-CXCR4組細(xì)胞STAT3、p-STAT3和cyclin D1的蛋白水平顯著降低(P<0.05)。

5 STAT3抑制劑對肺癌細(xì)胞活力和凋亡的影響

使用STAT3抑制劑NSC 74859作用于已轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞48 h，檢測細(xì)胞的活力、凋亡及磷酸化STAT3水平的變化，結(jié)果如圖5所示。與空白對照組相比，siRNA-CXCR4組和抑制劑組細(xì)胞中的p-STAT3蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與siRNA-CXCR4組細(xì)胞相比，細(xì)胞經(jīng)STAT3抑制劑作用后p-STAT3蛋白的水平顯著降低(P<0.05)。與空白對照組相比，siRNA-CXCR4組和抑制劑組細(xì)胞的活力顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著增加(P<0.05)；與siRNA-CXCR4組相比，細(xì)胞經(jīng)STAT3抑制劑作用后，活力明顯下降(P<0.05)，凋亡率顯著增加(P<0.05)。

討 論

趨化因子含有70～80個氨基酸，是一類與免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖和血管生成等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)的小分子蛋白[7]。CXCR4是最常見的趨化因子受體，在人體正常組織與細(xì)胞中低表達(dá)或者不表達(dá)，但在多種腫瘤組織中高表達(dá)[8-10]。越來越多的研究表明，CXCR4與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等多個生物學(xué)行為有關(guān)[11]。CXCR4對人體中發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)，近年來越來越多的學(xué)者對CXCR4基因的作用進(jìn)行深入研究，以期為肺癌可行性靶點(diǎn)治療提供新的思路。研究表明，CXCR4可通過多條信號通路調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡過程，并且誘導(dǎo)腫瘤血管生成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。CXCR4可通過自分泌和旁分泌2種方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管發(fā)生和凋亡等[13-14]。臨床研究也表明CXCR4通過與一系列的信號通路相互作用抑制非小細(xì)胞肺癌侵襲和遷移能力[15]。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在肺癌組織中過表達(dá)，提示CXCR4表達(dá)量增加在肺癌的演進(jìn)過程中起重要作用[16]。RNAi技術(shù)是采用腺病毒、慢病毒、細(xì)菌載體、多聚復(fù)合物和納米顆粒等載體攜帶目的基因以此抑制基因表達(dá)，主要用于研究基因調(diào)控的一種新手段[17-18]。因此本實(shí)驗(yàn)采用siRNA特異性沉默CXCR4基因結(jié)果顯示肺癌細(xì)胞NCI-H292的活力受到抑制，流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果表明細(xì)胞的凋亡率增加，cleaved caspase-3和PARP1蛋白水平明顯增加。但干擾CXCR4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制還不完全清楚。

Figure 3. The effects ofCXCR4 gene expression knockdown on lung cancer cell apoptosis (A) and the related protein levels (B). Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group.

圖3敲減CXCR4基因表達(dá)對肺癌細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

Figure 4. The effects ofCXCR4 gene expression knockdown on the protein levels of STAT3, p-STAT3 and cyclin D1 in lung cancer cells. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group.

圖4敲減CXCR4基因表達(dá)對肺癌細(xì)胞中STAT3、p-STAT3和cyclinD1蛋白水平的影響

STAT3信號通路是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子家族的成員之一，調(diào)控多種細(xì)胞因子和生長因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡等生物學(xué)過程[19]。近年來的研究表明，持續(xù)激活STAT3信號通路促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖和侵襲，導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[20]。當(dāng)細(xì)胞受到異常刺激時，STAT3被磷酸化成p-STAT3而形成二聚體，從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核中，與DNA的反應(yīng)原件結(jié)合，從而激活特定靶基因[21]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在白血病[22]、乳腺癌[23]和膀胱癌[24]組織中異常激活，對致癌信號的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，可激活下游靶基因，如cyclin D1、凋亡相關(guān)基因Bcl-xL及血管生成誘導(dǎo)基因等的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3信號通路通過調(diào)控下游靶基因cyclin D1及Bcl-xL的表達(dá)，有效抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[21]。NSC 74859是一種新發(fā)現(xiàn)的STAT3通路抑制劑，研究證實(shí)NSC 74859可特異性抑制STAT3從而影響腫瘤的生長。本實(shí)驗(yàn)中，干擾肺癌細(xì)胞中CXCR4基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，STAT3、p-STAT3和cyclin D1的蛋白水平顯著降低；采用STAT3抑制劑作用于已轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的p-STAT3的蛋白水平顯著降低，細(xì)胞活力受到顯著抑制，凋亡率顯著增加，提示CXCR4在肺癌細(xì)胞中可能通過抑制STAT3信號通路的激活從而誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長和凋亡過程。

Figure 5. The effects of STAT3 inhibitor on lung cancer cell viability (A), apoptosis (B) and p-STAT3 protein levels (C). Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vssiRNA-CXCR4 group.

圖5STAT3抑制劑對肺癌細(xì)胞活力、凋亡及p-STAT3蛋白表達(dá)量的影響

綜上所述，沉默CXCR4基因在肺癌中的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)其凋亡，可能是通過抑制STAT3信號通路的活化介導(dǎo)的下游靶基因的表達(dá)，因此CXCR4有望成為肺癌基因治療的新的靶點(diǎn)。