臍帶、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞改善肝硬化大鼠的效果比較

高琳琳， 王靜敏， 張艷鶴， 楊繼康

焦作市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 焦作 454002

肝硬化是由多種病因引起的肝臟終末狀態(tài)[1]，研究[2-3]顯示，干細(xì)胞為肝硬化治療帶來新的希望。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)、脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，研究[4-5]表明，兩者在抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)活性方面均有作用。本實驗探討兩種干細(xì)胞在肝硬化治療方面有無差異。

1 材料與方法

1.1材料和試劑SD大鼠40只，6周齡，體質(zhì)量220～260 g，購自鄭州大學(xué)動物實驗室；胎牛血清購自杭州四季青公司；Ⅳ型膠原酶購自Sigma公司；Livin、Smac兔多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司；SP9000試劑盒購自北京中杉生物工程公司。

1.2細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

1.2.1 UC-MSCs的分離培養(yǎng)：正常足月分娩的臍帶，PBS洗滌后剪小段，去除外膜、血管，剪碎后置于培養(yǎng)瓶中，加入質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次。細(xì)胞至80%匯合融合時，用質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰酶消化，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 ADSCs的分離培養(yǎng)：取大鼠脂肪組織約2 mg剪碎，加含1 mg/ml膠原酶的分離液，振蕩消化1 h，離心5 min后，將沉積的細(xì)胞加入質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的培養(yǎng)基，再次離心后，沉積的細(xì)胞加入培養(yǎng)基中，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，每3 d換液1次。細(xì)胞達(dá)80%融合時傳代。

1.3建模及干細(xì)胞移植選取SD大鼠35只，將質(zhì)量濃度為500 g/L的CCl4大豆油溶液，首次劑量按5 ml/kg行腹腔注射，之后按3 ml/kg腹腔注射，2次/周，共8周。隨機處死5只大鼠，肝臟組織切片看到假小葉形成，證實造模成功。依據(jù)實驗設(shè)計，將30只大鼠分為3組：UC-MSCs組10只，ADSCs組10只，對照組10只。干細(xì)胞移植：2 ml的細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)為5×106)分別緩慢注入UC-MSCs組和ADSCs組大鼠的尾靜脈中，每2周1次，等量生理鹽水同樣方法注入對照組。治療4周結(jié)束，取所有大鼠肝組織石蠟包埋。

1.4肝功能檢測治療前取大鼠尾靜脈血1.5～2 ml，肝細(xì)胞移植4周后，取大鼠左心室血2 ml，用生化儀器檢測肝功能丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)和總膽紅素(TBIL)的水平。

1.5肝組織病理學(xué)檢查觀察肝臟大體標(biāo)本。標(biāo)本用質(zhì)量濃度為100 g/L的甲醛固定72 h，石蠟包埋切片，常規(guī)行HE染色和Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)本。按Ishak評分標(biāo)準(zhǔn)修正方案[6]對肝組織炎癥活動及纖維化程度進(jìn)行評分。

1.6免疫組化檢測α-SMA石蠟切片脫臘脫水，PBS沖洗，體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2孵育，滴加α-SMA抗體，4 ℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，用蘇木精復(fù)染，酒精脫水，中性樹膠封片后觀察。光鏡下觀察，棕黃色部位為免疫組化陽性細(xì)胞。每張切片選取4個視野，采用圖像分析技術(shù)檢測每個視野中陽性細(xì)胞的積分光密度值。

2 結(jié)果

2.1UC-MSCs和ADSCs的培養(yǎng)生長

2.1.1 UC-MSCs培養(yǎng)：臍帶組織貼壁3 d后，大量細(xì)胞在周邊長出，大部分細(xì)胞形態(tài)呈梭形，原代細(xì)胞培養(yǎng)15 d左右80%～90%融合，傳代后，細(xì)胞增殖速度明顯增快，多次傳代后細(xì)胞形態(tài)均一，呈漩渦狀生長(見圖1)。

2.1.2 ADSCs培養(yǎng)：分離的細(xì)胞種植入培養(yǎng)皿中，48 h后有梭形和多角形細(xì)胞貼壁，3～5 d后細(xì)胞生長加快，呈梭形融合聚集，螺旋狀排列，達(dá)80%融合后傳代培養(yǎng)(見圖1)。

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞(100×) A：原代UC-MSCs；B：第3代UC-MSCs；C：原代ADSCs；D：第3代ADSCsFig 1 Mesenchymal stem cells (100×) A: primary UC-MSCs; B: the third generation UC-MSCs; C: primary ADSCs; D: the third generation ADSCs

2.2肝功能指標(biāo)檢測細(xì)胞移植前，三組肝功能指標(biāo)(AST、ALT、ALB及TBIL)相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療4周后，UC-MSCs組和ADSCs組與對照組比較，肝功能指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；UC-MSCs組與ADSCs組大鼠肝功能指標(biāo)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 移植后大鼠肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果Tab 1 Results of liver function in rats after transplantation U/L

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3組織病理學(xué)改變及病理評分HE和Masson染色均可見，對照組大鼠肝纖維化程度，膠原纖維包繞匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)，廣泛假小葉形成；UC-MSCs組和ADSCs組的肝組織內(nèi)膠原纖維成細(xì)絲狀，少于對照組，纖維化減輕，假小葉形成較對照組減少(見圖2)。結(jié)果顯示，治療組較對照組在肝組織炎癥活動度和纖維化程度評分等方面均有明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；UC-MSCs組與ADSCs組的肝組織評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 大鼠肝組織標(biāo)本病理評分Tab 2 Histopathological score of rat liver tissue

注：與對照組比較,*P<0.05。

圖2 三組大鼠肝臟病理學(xué)改變(200×)Fig 2 Hepatic pathological changes of rats in three groups (200×)

2.4肝組織α-SMA表達(dá)肝組織中α-SMA陽性細(xì)胞呈棕黃色，多呈成片狀或條索狀，主要分布于肝竇周圍、匯管區(qū)、纖維間隔。UC-MSCs組和ADSCs組α-SMA陽性細(xì)胞表達(dá)較對照組減少(見圖3)。UC-MSCs組、ADSCs組和對照組的α-SMA表達(dá)水平分別為：125.1±21.43、121.5±6.44、156.6±23.48。UC-MSCs組、ADSCs組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；UC-MSC組與ADSCs組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 三組大鼠肝免疫組化(200×) A：對照組；B：UC-MSCs組；C：ADSCs組Fig 3 Immunohistochemistry of liver in three groups (200×) A: control group; B: UC-MSCs group; C: ADSCs group

3 討論

肝硬化是各種慢性肝病最常見的發(fā)展結(jié)果，嚴(yán)重威脅人們的健康[7]。肝移植是最有效的手段，但供體缺乏及需要終身服免疫抑制劑等，限制其臨床應(yīng)用[8]。間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，在特定條件下具有多向分化潛能，作為新治療理念為肝硬化的治療帶來了希望[9]。UC-MSCs和ADCSs是間充質(zhì)干細(xì)胞的不同來源，研究[10]證實,兩種細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有相似的細(xì)胞表型標(biāo)志物及分化潛能，在體外可以穩(wěn)定增殖傳代，較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有更強的增殖能力。

HSC是肝內(nèi)的非實質(zhì)細(xì)胞，HSC激活后表達(dá)α-SMA，持續(xù)激活是肝臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11-12]。本研究分別將UC-MSCs和ADSCs注入肝硬化模型的大鼠體內(nèi)，大鼠的肝功能改善，肝臟α-SMA沉積減少，肝臟炎癥和纖維化程度都有所減輕。間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝硬化的機制尚未明確，有研究[13]認(rèn)為,主要有：干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞，再促進(jìn)肝臟再生；干細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如VEGF、IL-10等， 通過調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，抑制HSC的活化從而改善肝纖維化[14-15]。肝細(xì)胞樣細(xì)胞具有與人類肝細(xì)胞類似的功能。有研究[16]證明，將間充質(zhì)干細(xì)胞移植到肝損傷模型體內(nèi)后，通過免疫組化分析顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞沒有取代受損傷的肝細(xì)胞，而是定居在其周邊的區(qū)域。本實驗證明，間充質(zhì)干細(xì)胞可通過釋放可溶性因子進(jìn)行旁分泌行為，可能對組織的保護和修復(fù)起非常重要的作用。

綜上所述，UC-MSCs和ADSCs可以改善肝纖維化程度，給晚期肝病患者帶來新的選擇。兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的作用程度無顯著性差異，臨床可根據(jù)條件選擇合適的細(xì)胞來源，其可能的機制及應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究。干細(xì)胞治療雖然有很大的希望，但也有不確定性和局限性。我們需要分離和培養(yǎng)免疫特異性和均勻的干細(xì)胞群體，提高分化為靶細(xì)胞的效率，建立移植的最佳階段，提高移植后定植率和再生率。