商業(yè)化腐乳中乳酸菌的分離與鑒定

□ 張志超 湯臣倍健股份有限公司 羅劍鳴 暨南大學(xué) 殷光玲 湯臣倍健股份有限公司

腐乳（Sufu）是一種源自中國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品，以絮凝后的豆?jié){為底物經(jīng)多種微生物混合發(fā)酵而成的植物奶酪狀食品，可佐餐，亦可調(diào)味。在腐乳生產(chǎn)期間，前期發(fā)酵主要為生產(chǎn)菌株在豆腐坯繁殖和發(fā)酵，此時(shí)豆腐蛋白分解，淀粉糖化。后期發(fā)酵主要為酶與微生物的協(xié)同發(fā)酵，大豆蛋白被分解為低分子肽和必需氨基酸[1]，同時(shí)伴隨酯類、有機(jī)酸和醇類的生成[2]，共同形成腐乳特有的香味和色澤。雖然目前腐乳的商業(yè)化生產(chǎn)正朝著機(jī)械化的方向發(fā)展[3]，比如前期發(fā)酵使用純菌接種發(fā)酵代替自然發(fā)酵，之后直接裝瓶進(jìn)行后期發(fā)酵，但是目前仍以傳統(tǒng)工藝為主，傳統(tǒng)生產(chǎn)中仍然存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、影響因素多、生產(chǎn)效率低、安全隱患大等缺點(diǎn)[4]。豆腐坯在前期接種純菌后，會(huì)置于敞開(kāi)的自然條件下進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵，外加發(fā)酵時(shí)間比較長(zhǎng)（3～6個(gè)月），難免會(huì)有各種微生物生長(zhǎng)，給產(chǎn)品的品質(zhì)、食用安全性帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。

乳酸菌廣泛存在于各類發(fā)酵大豆制品中，乳酸菌作為一類能夠發(fā)酵糖大量生產(chǎn)乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其代謝產(chǎn)物不僅影響產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味和品質(zhì)，并且能夠抑制腐敗微生物，延長(zhǎng)保質(zhì)期。有研究表明，從特定發(fā)酵食品中分離鑒定出的乳酸菌可以被認(rèn)為是該食品進(jìn)行發(fā)酵的最佳發(fā)酵菌株，并且比其他來(lái)源的乳酸菌具有更強(qiáng)的適應(yīng)力和競(jìng)爭(zhēng)力。本文對(duì)市售占比較高的10種腐乳進(jìn)行選擇性分離，并對(duì)篩目標(biāo)菌株進(jìn)行基因分子鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

腐乳（白方、青方、紅方）：樣品購(gòu)于各大超市，均在保質(zhì)期內(nèi)，于室溫下保存。MRS培養(yǎng)基，購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；納他霉素，購(gòu)于丹尼斯克。

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型），購(gòu)于TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司；溴化乙錠（EB），TE 緩沖液，5 × TBE電泳緩沖液蛋白酶K，Lyticase，dNTP，10 × PCR Buffer，Loading Buffer，r -Taq 酶，購(gòu)于上海生工有限公司。引物及其他酶制劑由英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成提供。

1.2 儀器與設(shè)備

WS- CJ- 1F 型雙面單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電子天平（XB120A），沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；便攜式pH 計(jì)（Mettler Toledo S20K pH meter） 梅 特 勒 -托利多儀器（上海）有限公司；Thermo CO2培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱，Thermo 公司；Bio-RAD C100TM Thermal cycler PCR 儀（Bio-Rad，Hercules， CA， USA） ，美國(guó)ABI公司； 凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 2500），中國(guó)天能公司；Sub- Cell GT BASIC 型電泳儀，意大利Bio- Rad 公司離心機(jī)（5804R），德國(guó)Eppendorf公司；手提式壓力蒸汽滅菌器（SYQDXS-280A），上海申安醫(yī)療器械廠PL602- S 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品計(jì)數(shù)與分離純化

取2g腐乳樣品，溶解于18mL去離子水中，均質(zhì)機(jī)均質(zhì)30s后，作為10-1備用。

制備樣品梯度稀釋液→每個(gè)稀釋梯度各取100 μL 涂布于添加納他霉素的MRS 培養(yǎng)基→37 ℃厭氧倒置培養(yǎng)→ 挑取不同形態(tài)的菌落→通過(guò)平板劃線分離法反復(fù)分離純化→顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)鑒定→在MRS 液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)→甘油管冷凍保存。

1.3.2 16S rDNA序列分析與鑒定

將以上MRS肉湯培養(yǎng)物按照TIANGEN公司的細(xì)菌基因組DNA的提取操作說(shuō)明，將提取到的各細(xì)菌基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA引物，進(jìn)行特異性PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完畢后，利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小。將有目標(biāo)片段的PCR反應(yīng)產(chǎn)物用DNA測(cè)序儀進(jìn)行16S rDNA序列分析，分析結(jié)果與GenBank中的基因序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，以序列同源性大于99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌種歸類。

50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：去離子雙蒸水 33.7 μL，5×PCR buffer 10 μL，2.5mM dNTP buffer 4 μL，上下游引物共2 μL，GoTaq DNA 酶 0.3 μL。

PCR擴(kuò)增引物：正向引物為27F :5’-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’；反向引物為1319R: 5’- ACGGGCGGTGTGTAC-3’。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5min；95 ℃變性1 min，60℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72℃延伸5 min，4 ℃保溫。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐乳樣品中乳酸菌的分離

使用MRS培養(yǎng)基從樣品中分離LAB，但由于菌落發(fā)酵過(guò)程中微生物的多樣性，每個(gè)樣品都呈現(xiàn)出不同形態(tài)的菌落以及菌落數(shù)量（表1）。通過(guò)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，去除霉菌、酵母形態(tài)的菌落，共選擇162株球狀或桿狀菌株進(jìn)行鑒定。各個(gè)樣品所選擇的進(jìn)行鑒定的菌落數(shù)量見(jiàn)表1。

培養(yǎng)2 d后，所有樣品中的菌落總數(shù)從1.2E + 02至1.5E + 04，不同樣品之間差異較小。 但在培養(yǎng)到7 d時(shí)，F(xiàn)R01、FR03、FR05、FR07、FR08 出現(xiàn)小菌落，F(xiàn)R07樣品中小菌落數(shù)量最高（7.584Log CFU/g）。

表1 MRS培養(yǎng)基上分離、純化出的疑似菌株

表2 分離自腐乳樣品中162株16S rDNA序列鑒定結(jié)果

2.2 篩選菌株16S rDNA序列鑒定結(jié)果

從以上方法中分離純化得到的162株菌通過(guò)基因組16S rDNA 序列鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

不同的腐乳樣品中菌落種類差異較大。MRS培養(yǎng)基中篩選出的菌株大約90%為革蘭氏陽(yáng)性菌，因?yàn)楦锾m氏陽(yáng)性菌對(duì)鹽和乙醇的耐受性相對(duì)強(qiáng)于革蘭氏陰性菌[5]。FR04樣品在MRS肉湯中沒(méi)有生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)闃悠飞L(zhǎng)環(huán)境與MRS培養(yǎng)液不同導(dǎo)致。乳酸菌 屬 從 FR02、FR03、FR06、FR07、FR08共5個(gè)腐乳樣品中分離出來(lái)，F(xiàn)R02、FR03均為植物乳桿菌（L.plantarum），這與魯緋等[6]從青方腐乳中分離得到植物乳桿菌結(jié)果相一致。FR06樣品中篩選鑒定出較多數(shù)量的嗜酸乳桿菌（L.acidipiscis），而來(lái)自FR07、FR08樣品中的小菌落鑒定為嗜鹽乳桿菌（L.halophilus），這種嗜鹽細(xì)菌在鹽濃度正常的MRS培養(yǎng)基中存在緩慢生長(zhǎng)現(xiàn)象，有文獻(xiàn)表明在許多品牌的腐乳中都能發(fā)現(xiàn)比較高數(shù)量級(jí)的嗜鹽乳酸菌[7]。

芽 孢 桿 菌 屬 在 FR03、FR05、FR06、FR07、FR08、FR09和 FR10共7個(gè)樣品中有檢測(cè)到，比乳桿菌屬占比更高。其中包括凝結(jié)芽孢桿菌（B.coaqulans），蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、人參土芽孢桿菌（ B.qinssengihumi）和枯草芽孢桿菌（B. subtili）。10個(gè)腐乳樣品中共有5個(gè)樣品分離出蠟樣芽孢桿菌，通常被學(xué)者認(rèn)為其在食物中的含量超過(guò)105CFU/g（mL）時(shí)就有可能帶來(lái)中毒癥狀，而蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的腸毒素容易導(dǎo)致一些食源性疾病的產(chǎn)生[8]，有文獻(xiàn)指出，蠟樣芽孢桿菌污染腐乳的主要中間產(chǎn)品為酸漿水、種水和鹽水[9]。僅在菌株多樣化程度最高的FR07樣品中檢測(cè)到腸球菌屬屎腸球菌（E.faecium），有研究表明，大多數(shù)腸桿菌科不耐受鹽濃度升高[10]，所以以上樣品中均未檢測(cè)到腸桿菌科。

3 結(jié)論

不同來(lái)源的腐乳的細(xì)菌組成差異很大，表明不同腐乳生產(chǎn)地區(qū)的微生物差異很大，這可能是因?yàn)橹谱鞒绦?，發(fā)酵菌株與生產(chǎn)廠家環(huán)境的差異，這一點(diǎn)也在文獻(xiàn)研究中被證實(shí)[8]。從10種市售腐乳中共分離得到4種乳酸菌，經(jīng)16S rDNA鑒定，分別為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜鹽乳酸菌以及乳桿菌Akporo7 ，為乳酸菌應(yīng)用在商業(yè)化腐乳發(fā)酵，抑制腐敗微生物提供研究支持。