ELISA可視化微陣列芯片法檢測蜂蜜中硝基呋喃類藥物的殘留量

□ 許月明 潘言方 李慧慧 蕪湖職業(yè)技術(shù)學院

硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經(jīng)被廣泛應用，并作為雞肉、禽類、水產(chǎn)和豬的促生長添加劑使用。但在長時間的實驗研究過程中發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物和代謝物均可能導致實驗動物發(fā)生癌變和基因突變。鑒于此，硝基呋喃類藥物在1995年已經(jīng)在治療和飼料中禁用。硝基呋喃類藥物在體內(nèi)很快被代謝，但其代謝產(chǎn)物在組織中則能存留較長時間。因此管理部門在檢測硝基呋喃類藥物殘留時通常也分析此類藥物的代謝產(chǎn)物的含量。

ELISA可視化微陣列芯片檢測系統(tǒng)可對單個樣本中多個硝基呋喃類藥物代謝產(chǎn)物進行同時定量檢測，并配套有相關(guān)檢測設備，可以使檢測效率比傳統(tǒng)實驗室的分析方法如LC、LCMS、LC-MS/MS、ELISA方法等更高效，具有操作簡單、檢測速度快、檢測樣本量大、精確度和靈敏度好等特點，且自動化程度高。

1 檢測原理

ELISA可視化微陣列芯片用于蜂蜜等樣品中抗生素殘留檢測是基于間接競爭免疫分析原理。ELISA可視化微陣列芯片微孔中包含有識別多個硝基呋喃抗生素代謝物分子的人工抗原點，當在微孔反應區(qū)內(nèi)加入待測抗生素樣品與相應抗體后，游離的待測物和芯片上固定的人工抗原點競爭結(jié)合相應的抗體。因此游離的待測物越多，抗體與固定在芯片上的相關(guān)抗原點的結(jié)合量就越少。待反應完畢洗滌后，加入納米催化顯色試劑，納米顆粒經(jīng)催化反應而直徑顯著增加，在芯片表面形成肉眼可見的黑色斑點。各黑色斑點通過芯片分析儀自動掃描檢測后可獲得各斑點的相關(guān)灰度值。由于樣品中殘留的抗生素含量與樣品的灰度值呈負相關(guān)，經(jīng)芯片分析軟件與標準曲線自動比較計算后，即可得出各相關(guān)硝基呋喃代謝物的含量，可實現(xiàn)多個硝基呋喃代謝物的同時定量檢測。

2 實驗儀器和試劑

2.1 實驗儀器

芯片分析儀、均質(zhì)器、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管（10mL）、天平（感量 0.1g）、容量瓶（100mL）、洗板機、恒溫振蕩儀、玻璃試管10mL，聚苯乙烯離心管50mL、2mL。微量移液器：單道20～200 μL，100～1000 μL，1000～5000 μL。

2.2 實驗試劑

甲醇、氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、濃鹽酸、三水合磷酸氫二鈉、去離子水，均為分析純。

2.3 溶液的配制

2.3.1 磷酸鹽緩沖液

稱取22.8g三水合磷酸氫二鈉，加入1 L去離子水溶解混勻。

2.3.2 1mol/L鹽酸溶液

移取8.3mL濃鹽酸（12mol/L，質(zhì)量分數(shù)37%），加入去離子水定容至100mL，混勻。

2.3.3 1mol/L氫氧化鈉溶液

稱取4.0g氫氧化鈉加入100mL去離子水溶解混勻。

2.3.4 洗滌工作液

用去離子水將20X濃縮洗滌液按1∶19體積比進行稀釋（一份20X濃縮洗滌液+19份去離子水）用于芯片板的洗滌，洗滌工作液在4℃（39.2℉）環(huán)境可保存一個月。

2.4 ELISA可視化微陣列芯片組成（96T）

2.4.1 微量測試孔

每條8孔，一板12條。

2.4.2 標準液6瓶

標準液0.5mL/瓶，包括AMOZ、AOZ、SEM、AHD的標準液，詳細信息見表1。

2.4.3 其他溶液

抗體工作液 3mL，二抗工作液6mL，顯色液A 4mL，顯色液B 4mL，20X濃縮洗滌液 25mL，衍生化試劑10mL，樣本復溶工作液 50mL。

3 實驗內(nèi)容

3.1 蜂蜜樣品的前處理（稀釋倍數(shù)：1倍）

稱取1g蜂蜜樣品至50mL聚苯乙烯離心管中，依次加入4mL去離子水，500 μL 1mol/L 鹽酸溶液，100 μL 衍生化試劑；用振蕩儀（2400r/m）振蕩30 s；在60℃水浴下，孵育2 h（注意：此衍生反應步驟可用如下步驟代替：在37℃下，孵育14 h左右，效果相同。）

孵育完成后依次加入以下試劑：5mL磷酸鹽緩沖液，400 μL 1mol/L氫氧化鈉溶液，6mL乙酸乙酯；用振蕩儀（2400r/m）振蕩3min；在25℃4500rpm轉(zhuǎn)速下離心15min；移取3mL上層乙酸乙酯至10mL干凈干燥的玻璃試管中，于50℃下氮氣吹干；加入1mL正己烷，用振蕩儀（2000r/m） 振 蕩 3min， 再 加 入 500 μL 樣 本復溶工作液，用振蕩儀（2000r/m）振蕩3min；移入2mL聚苯乙烯離心管中，在12000r/m轉(zhuǎn)速條件下離心15min；去除上層有機相，取下層水相25μL用于分析（如果很難通過正己烷層移取較低水狀層，可以先取500 μL較低層后重復步驟7，然后再移取50 μL較低水狀層用于實驗。）

表1 標準品種類及呋喃代謝物

表2 檢測項目及檢測靈敏度

表3 檢測項目及交叉反應率

表4 呋喃它酮代謝物AMOZ實驗結(jié)果

3.2 檢測步驟

（1）使用30min以上（注意：每種液體試劑使用前均須搖勻，所有試劑需避光保存）前將芯片置于室溫（20～25℃）平衡。

（2）取出需要數(shù)量的芯片微孔條插入框架中，確保其水平穩(wěn)固。將不用的微孔條放入自封袋密封，保存于2～8℃，不要冷凍。

（3）編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品均做雙孔平行。

（4）加樣：依次加入25 μL樣品或標準品和25 μL抗體工作液到各自的微孔中，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25℃ 600r/m振蕩速度下反應45min。

（5）洗板：小心揭開蓋膜板，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μL/孔 洗滌反應孔，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清楚的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

（6）在每孔中加入二抗工作液50μL/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，37℃ 600r/m振蕩速度下反應30min，取出重復步驟5。

（7）顯色：顯色液A和顯色液B臨用過時1∶1混合均勻（注意：過早混勻?qū)⒂绊懡Y(jié)果的檢測）。每孔加入混合液50 μL，37℃ 600r/m 避光顯色約12min。（如若微孔內(nèi)黑色沉淀較深或較淺，可適當縮短或延長反應時間，但顯色時間應控制在11～13min內(nèi)。）

取出重復步驟5。

表5 呋喃唑酮代謝物AOZ實驗結(jié)果

表6 呋喃西林代謝物SEM實驗結(jié)果

（8）測定：將顯色后的芯片放入芯片分析儀中獲取圖像，啟用默認的芯片專用軟件進行自動化分析，結(jié)果報告將自動生成。

3.3 ELISA可視化微陣列芯片技術(shù)指標

3.3.1 檢測項目及靈敏度（見表2）

3.3.2 交叉反應率（見表3）

表7 呋喃妥因代謝物AHD實驗結(jié)果

4 實驗結(jié)果

4.1 呋喃它酮代謝物AMOZ實驗結(jié)果（見表4）

4.2 呋喃唑酮代謝物AOZ實驗結(jié)果（見表5）

4.3 呋喃西林代謝物SEM實驗結(jié)果（見表6）

4.4 呋喃妥因代謝物AHD實驗結(jié)果

（見表7）

4.5 結(jié)論

蜂蜜中要求硝基呋喃類四類代謝物濃度要≤0.2μg/L，且四類代謝物濃度的和要＜0.5μg/L，所以試驗所得編號為19和24不合格，其他均合格。

5 檢測注意事項

向孔內(nèi)移液時，移液嘴朝向芯片的前邊緣，不要接觸到芯片表面；所有樣品和試劑的添加，洗滌和孵育都要在芯片架上完成；在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔內(nèi)干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的線性；應注意洗板拍干后立即進行下一步操作；不要使用超過有效日期的芯片；不要交換使用不同批號的盒中試劑；稀釋試劑或摻雜使用芯片板條會引起靈敏度、信號值的變化。