“森淼”文冠果新品系組織培養(yǎng)技術(shù)

王 娟，王 薇

(1.陜西省林業(yè)國(guó)際合作項(xiàng)目管理中心；2.陜西省林業(yè)教育培訓(xùn)站，西安 710082)

文冠果(Xanthocerassorbifolium)是無(wú)患子科文冠果屬落葉灌木或小喬木，別名文官果、崖木瓜等，是中國(guó)特有的溫帶木本油料植物[1]，其種子含油率最高可達(dá)66%，可食用，有“北方油茶”之美譽(yù)[2]。文冠果種子可生產(chǎn)柴油和高級(jí)潤(rùn)滑油，是我國(guó)重點(diǎn)發(fā)展的生物燃油樹(shù)種[3]，加之文冠果耐半陰，對(duì)土壤適應(yīng)性強(qiáng)，耐瘠薄和鹽堿，抗寒抗旱[4]，發(fā)展前景可觀。文冠果“森淼”新品系具有物候晚、兩性花/總花數(shù)量比例高、腋部花芽結(jié)果、產(chǎn)量穩(wěn)定等特性，在西北地區(qū)具有推廣優(yōu)勢(shì)[5]。但因其扦插生根率和嫁接成活率都比較低，且存在位置及成熟等效應(yīng)，繁殖材料容易發(fā)生種性退化等特點(diǎn)[6-9]，導(dǎo)致生產(chǎn)用種苗嚴(yán)重不足。組織培養(yǎng)因其繁殖系數(shù)高、繁殖周期短、可復(fù)壯等優(yōu)點(diǎn)[10]，在良種快繁中越來(lái)越受到重視。“森淼”品系組織培養(yǎng)有望解決其種苗缺乏、常規(guī)無(wú)性繁殖種性退化等問(wèn)題。目前，文冠果樹(shù)種組織培養(yǎng)研究還處于初步探索階段，鮮有的幾篇文獻(xiàn)主要集中在莖段培養(yǎng)[4,10]、愈傷組織誘導(dǎo)與分化[8]、生根培養(yǎng)[11]、體胚誘導(dǎo)[12]等方面。使用的外植體主要有三種：生長(zhǎng)季半木質(zhì)化莖段[4,10]、生長(zhǎng)季離體幼嫩葉片[8]、不同發(fā)育階段的種胚[12]。因后兩類(lèi)外植體在形態(tài)建成中均需經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，有可能發(fā)生變異[9]，一般不宜作為良種繁育的途徑。莖段培養(yǎng)雖然取得了一定結(jié)果，但均存在啟動(dòng)培養(yǎng)污染率高、增殖系數(shù)低、生根數(shù)少、培養(yǎng)效果重復(fù)性差的問(wèn)題[4,8,10]。目前還沒(méi)有“森淼”品系的組織培養(yǎng)研究報(bào)道。為此，本研宄在前人研究基礎(chǔ)之上，考慮文冠果樹(shù)種的生殖生物學(xué)特性，以“森淼”品系休眠枝水培獲得的嫩莖為外植體，系統(tǒng)研究消毒時(shí)間、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比等對(duì)“森淼”品系啟動(dòng)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)與生根培養(yǎng)的影響，以期建立一種啟動(dòng)培養(yǎng)快、污染小、增殖與生根效果較好的“森淼”品系組培快繁技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于12月中旬，采集“森淼文冠果”優(yōu)良單株大樹(shù)上的當(dāng)年生休眠枝條，修剪成50 cm長(zhǎng)的節(jié)段，于溫室(25±2)℃條件下水培，期間每3 d換一次水，并及時(shí)修剪枝條下部腐爛部分。用水培萌發(fā)的長(zhǎng)約10 cm左右的嫩枝作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 研究方法

1.2.1 初代培養(yǎng) 將水培獲得的新生嫩枝修剪成帶一個(gè)腋芽的莖段，70%酒精浸潤(rùn)30 s，然后用0.1%升汞消毒不同時(shí)間后，再用無(wú)菌水沖洗4～5次，接種在附加1.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1IBA的MS培養(yǎng)基中，于(25±2)℃、14 h光照、2000lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)外植體污染率和存活率。升汞消毒時(shí)間設(shè)置5 min、8 min、11 min三個(gè)時(shí)間梯度，每個(gè)梯度接種30瓶。

1.2.2 增殖培養(yǎng) 以初代培養(yǎng)中獲得的大于2 cm的無(wú)菌腋芽為試材，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基附加不同濃度組合的6-BA和IBA。6-BA濃度設(shè)置1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1兩個(gè)梯度，IBA濃度設(shè)置0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1兩個(gè)梯度，共組合成4種增殖培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基接種外植體15瓶。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)、芽長(zhǎng)度，觀察記錄芽生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.3 生根培養(yǎng) 以增殖培養(yǎng)獲得的大于2 cm的健壯無(wú)菌芽為材料， 以 1/2MS為(大量元素減半，20 g·L-1蔗糖)為基本培養(yǎng)基，分別添加0.1、0.3、0.5、1.0 mg·L-1NAA和0.1、0.3、0.5、1.0 mg·L-1IBA，與不添加任何生長(zhǎng)素的1/2MS，共組成9種生根培養(yǎng)基，篩選“森淼”文冠果不定芽生根的最適培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基接種無(wú)菌芽15個(gè)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)、根長(zhǎng)，計(jì)算生根率，觀察記錄根系生長(zhǎng)狀態(tài)。培養(yǎng)條件同上。

1.2.4 培養(yǎng)基蔗糖、瓊脂、pH值 上述方法中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所有培養(yǎng)基中的蔗糖濃度均為30 g·L-1，瓊脂濃度為7 g·L-1，pH5.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)休眠枝水培嫩枝啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

建立無(wú)菌體系并且使其發(fā)育，是植物組織培養(yǎng)快速繁殖的基礎(chǔ)。啟動(dòng)培養(yǎng)的目的獲得大量無(wú)污染且能夠快速萌發(fā)的新芽，這其中培養(yǎng)基與消毒劑和消毒時(shí)間最為關(guān)鍵。鑒于已有報(bào)道，針對(duì)文冠果啟動(dòng)培養(yǎng)中污染率較高的問(wèn)題，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在外植體選擇上使用休眠枝溫室水培獲得的嫩枝作為外植體，因其在相對(duì)密閉的溫室環(huán)境，外植體攜帶的雜菌相對(duì)較小，從源頭上控制污染率。同時(shí)，針對(duì)這種相對(duì)幼嫩的外植體，研究篩選最佳消毒時(shí)間。

結(jié)果表明(表1)，0.1%的升汞可作為“森淼”品系休眠枝水培嫩枝初代培養(yǎng)的良好消毒劑，但消毒時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。消毒5 min和8 min時(shí)外植體均可存活，無(wú)死亡現(xiàn)象，但5min條件下的外植體污染率較高，達(dá)26.7%，8 min的污染率最低，只有6.7%。消毒時(shí)間大于8 min，延長(zhǎng)至11 min時(shí)，雖然沒(méi)有外植體污染，但有約60%的外植體死亡，這可能是由水培新枝太幼嫩，沒(méi)有木質(zhì)化造成的。綜上，對(duì)于文冠果休眠枝水培嫩枝的消毒時(shí)間控制在8 min左右為最佳。

表1 消毒時(shí)間對(duì)“森淼”文冠果啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

因啟動(dòng)培養(yǎng)的主要目的是使腋芽順利萌發(fā)，獲得無(wú)菌材料，根據(jù)扦插原理，即使培養(yǎng)基中不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，腋芽也可萌發(fā)，啟動(dòng)培養(yǎng)中添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的目的是加速腋芽萌發(fā)。為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，參考他人研究結(jié)果[9]，本研究啟動(dòng)培養(yǎng)只選用了一種培養(yǎng)基，即MS附加1.0 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1IBA。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看(圖1)，在該培養(yǎng)基中，所有存活外植體的腋芽均能正常萌發(fā)，且啟動(dòng)萌發(fā)時(shí)間短，外植體接種10 d后，腋芽開(kāi)始膨大顯綠，20 d后，開(kāi)始萌發(fā)，萌發(fā)的腋芽顏色、生長(zhǎng)狀態(tài)均正常。因此，“森淼”品系啟動(dòng)培養(yǎng)可用此培養(yǎng)基。

圖1 “森淼”品系啟動(dòng)培養(yǎng)

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)無(wú)菌芽增殖的影響

增殖培養(yǎng)是組織培養(yǎng)良種快繁的關(guān)鍵，決定著組培快繁的繁殖系數(shù)。增殖培養(yǎng)中最關(guān)鍵的影響因素是細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的濃度與配比。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)不同6-BA和IBA組合，探討了兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)“森淼文冠果”組培苗增殖效果的影響。結(jié)果顯示(表2)，6-BA與IBA的濃度與配比，均可影響組培苗的增殖倍數(shù)、芽高度及生長(zhǎng)狀態(tài)。

表2 6-BA和IBA對(duì)“森淼”品系無(wú)菌芽增殖的影響

6-BA在1.0～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)，濃度越高，增殖效果越好，1.0 mg·L-1時(shí)，每個(gè)外植體平均增殖芽數(shù)累計(jì)為1.4個(gè)，平均苗高2.4 cm。2.0 mg·L-1時(shí)，平均增殖芽數(shù)累計(jì)為5.8個(gè)，平均苗高2.6 cm。

NAA在0.5～1.0 mg·L-1范圍內(nèi)，濃度越高，越不利于增殖，0.5 mg·L-1時(shí)，平均增殖芽數(shù)累計(jì)為5.1，平均苗高2.9 cm，增殖的芽子生長(zhǎng)正常，粗壯。1.0 mg·L-1時(shí)，平均增殖芽數(shù)累計(jì)2.1，平均苗高2.1 cm，增殖的芽子不夠健壯，且在基部會(huì)產(chǎn)生少許愈傷組織。

在4種培養(yǎng)基組合中，2.0 mg·L-16-BA與0.5 mg·L-1NAA組合增殖效果最好，平均增殖芽數(shù)與芽平均長(zhǎng)度最高，分別為3.7個(gè)和3.1 cm，芽生長(zhǎng)正常，健壯。

2.3 生長(zhǎng)素對(duì)無(wú)菌芽生根的影響

生根培養(yǎng)是組培苗從實(shí)驗(yàn)室走向大田的關(guān)鍵，影響外植體生根的主要因素是生長(zhǎng)素種類(lèi)及其濃度。因文獻(xiàn)報(bào)道文冠果組培苗生根較困難，為此，本實(shí)驗(yàn)論文對(duì)IBA與NAA分別設(shè)置了4個(gè)濃度梯度，加上不添加任何生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基，共組合成9種生根培養(yǎng)基，研究?jī)煞N生長(zhǎng)素對(duì)文冠果組培苗生根的影響。

表3 生長(zhǎng)素對(duì)“森淼”文冠果無(wú)菌芽生根的影響

結(jié)果表明(表3)，生長(zhǎng)素對(duì)“森淼”品系不定根的形成有著明顯的促進(jìn)作用。在不含任何生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中,組培苗未形成不定根，說(shuō)明文冠果組培苗生根過(guò)程中附加生長(zhǎng)素是必要的。

表3數(shù)據(jù)顯示，IBA有明顯促進(jìn)“森淼”品系生根的作用，隨著IBA濃度的提高，其促進(jìn)生根能力逐步上升，當(dāng)達(dá)到0.5 mg·L-1時(shí)，生根能率最高，可達(dá)91.4%，平均生根數(shù)8.4條，平均根長(zhǎng)3.2 cm(圖2)。IBA濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)，盡管評(píng)價(jià)根數(shù)與根長(zhǎng)與0.5 mg·L-1時(shí)的差異不大，但生根率下降了近10個(gè)百分點(diǎn)，且生根部位的愈傷組織明顯，不利于將來(lái)的移栽成活。

圖2 “森淼”品系無(wú)菌芽在附加0.5 mg·L-1 IBA培養(yǎng)基中的生根情況

NAA也具有促進(jìn)生根的能力，但其效果較IBA差很多，最高生根率只有37.1%，誘導(dǎo)的根數(shù)及根長(zhǎng)均不及IBA。在0.1～0.5 mg·L-1范圍內(nèi)， NAA濃度對(duì)生根率的影響趨勢(shì)同IBA,但對(duì)平均根數(shù)和根長(zhǎng)影響不大。當(dāng)NAA濃度超過(guò)1.0 mg·L-1時(shí)，生根效果下降明顯。在含NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的根整體比IBA中誘導(dǎo)的較短，根系不伸展、扭曲，并且在根的周?chē)嬖谝欢康挠鷤M織。

根據(jù)IBA、NAA不同濃度對(duì)生根的影響，篩選出“森淼”品系無(wú)菌芽最適生根培養(yǎng)基為1/2MS附加0.5 mg·L-1IBA,由此誘導(dǎo)出的根系的質(zhì)量較好,并且在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的組培苗根部沒(méi)有愈傷組織形成，有利于下一步移栽成活。

3 討論

本研究篩選了適合“森淼”品系休眠枝條水培嫩枝組織培養(yǎng)的消毒時(shí)間、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，通過(guò)外植體選取、消毒時(shí)間控制，有效解決了文冠果組織培養(yǎng)中啟動(dòng)培養(yǎng)污染率高的問(wèn)題，通過(guò)對(duì)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的的濃度配比控制，提高了文冠果無(wú)菌芽的繁殖系數(shù)和生根率，研究結(jié)果對(duì)優(yōu)良文冠果工廠化育苗及進(jìn)一步分子育種具有促進(jìn)作用。

研究表明，休眠枝溫室水培獲得的嫩枝，因培養(yǎng)環(huán)境相對(duì)封閉、干凈，新生枝條能夠攜帶的微生物極少，所以消毒前既未采用流水沖洗，消毒時(shí)間也只有8 min，卻能將污染率控制在10%以內(nèi)。這說(shuō)明，對(duì)于休眠比較淺的樹(shù)種，選擇適宜的外植體，從源頭控制污染，可能是降低啟動(dòng)培養(yǎng)外植體污染率的最佳選擇。

研究結(jié)果顯示，“森淼”品系組培苗的增殖性能較差，在研究所涉及的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度范圍內(nèi)，每個(gè)外植體平均增殖芽數(shù)最高僅為3.7個(gè)，依然不能滿足工廠化育苗的要求。因此，后續(xù)研究重點(diǎn)之一是擴(kuò)大基本培養(yǎng)基種類(lèi)范圍、細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素種類(lèi)及濃度的范圍，系統(tǒng)研究影響文冠果組培苗增殖的各種可能因素，大幅度提高增殖系數(shù)，這樣才能降低公廠化育苗中的投入產(chǎn)出比。

生根培養(yǎng)是決定組培快繁能否從實(shí)驗(yàn)室走向大田的關(guān)鍵，影響組培苗生根的因素很多，有基本培養(yǎng)基、生長(zhǎng)素種類(lèi)及比例、生長(zhǎng)素的搭配使用、外植體內(nèi)源生長(zhǎng)素的含量、以及培養(yǎng)基中的蔗糖濃度等[10]。系統(tǒng)研究各因素對(duì)文冠果無(wú)菌芽生根的影響，將是今后應(yīng)該研究的重點(diǎn)內(nèi)容。