結球菊苣葉總黃酮提取工藝研究

劉馨瑤， 李金秒， 張利萍， 張萬忠

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

結球菊苣(knot ball chicory)又稱為紅菊苣，菊科，屬多年生草本植物，是一種葉菜，是海水蔬菜的一種，起源于地中海沿岸中亞和北非，歐美國家普遍種植，特雷維索紅菊苣和維羅納紅菊苣享有巨大的好評,當?shù)孛磕晟a250 000 t[1].菊苣含有大量的天然化學成分，如菊糖、有機酸類、生物堿類、香豆素類、三萜類、倍半萜內酯類等，現(xiàn)已確定的化合物有乙酸降香萜烯醇脂、α-香樹脂醇、蒲公英萜酮、胡蘿卜苷、山萵苣苦素、菊粉、高果糖漿、低果聚糖等[2].人類早在古代就開始使用菊苣，主要是利用它的藥用價值，即健胃消食，也可用于解葷膩，還有清肝利膽的功效.結球菊苣同樣具有抗氧化活性,結球菊苣中水溶性黃酮類化合物存在著特殊效用,流行病學研究描述了許多類黃酮對預防癌癥、心血管疾病和衰老的有益影響[3].結球菊苣提取物具有許多的生理活性,比如抗炎作用、增強免疫能力、降低血糖和膽固醇等[4-5].菊苣根可增進消化器官的活動機能，增強食欲；高濃度根制劑可增強胃分泌，卻不增進平滑肌張力[6].隨著人們生活水平的不斷提高，人們對綠色食品市場需求也不斷增加，而菊苣由于味道有些苦，從而減少了蟲害，避免了大量使用農藥，其可以作為蔬菜食用[7-8].

目前，對黃酮類物質的提取研究在國內外已經成為一個熱點，黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為母核的多酚類化合物，常連接甲基、甲氧基、異戊烯基、酚羥基等官能團,可與糖結合生成苷[9-10].植物中含有豐富的黃酮類化合物，黃酮普遍應用于醫(yī)藥、食品和化工等領域中[10-11].結球菊苣中含有豐富的黃酮、皂苷、多糖和三萜類化合物，本實驗以結球菊苣葉為原料，探討乙醇加熱回流提取法提取結球菊苣葉中總黃酮的工藝，從而為結球菊苣的綜合利用提供參考.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

結球菊苣，海城市三星生態(tài)農業(yè)有限公司；蘆丁對照品，索萊寶公司；無水乙醇、體積分數(shù)95 %乙醇、亞硝酸鈉試劑、硝酸鋁試劑、氫氧化鈉試劑均為分析純.

FA1104電子天平，沈陽杰龍儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；RE-6000旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生物儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器責任公司；WFZ-UV 2000紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理

將結球菊苣葉風吹除塵，真空干燥，粉碎研磨，過40目篩，得結球菊苣粉末，留存?zhèn)溆?

1.2.2 標準曲線的繪制

參照藥典[12]所記載測定繪制標準曲線，精密稱取蘆丁對照品3.2 mg放置于100 mL容量瓶中，加入體積分數(shù)為70 %的乙醇至刻度，混合均勻，制成質量濃度為0.032 g/L的標準品溶液，依次精密稱取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mL標準品溶液，分別置于試管中，各加入質量分數(shù)為5 %的亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻，靜置6 min，各加入質量分數(shù)為10 %的硝酸鋁0.6 mL，搖勻，靜置6 min，再各加入質量分數(shù)為4 %的氫氧化鈉4 mL，搖勻，靜置15 min，以第一瓶作為空白對照，在510 nm處測其紫外吸光度，依次記錄數(shù)據(jù)，并繪制以蘆丁質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標的標準曲線.

1.2.3 總黃酮提取工藝流程

結球菊苣粉末→加熱回流提取→過濾→提取液濃縮→干燥→菊苣總黃酮含量測定.

1.2.4 總黃酮提取的單因素試驗

以總黃酮的提取率為分析指標，分別研究比較不同的乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度、料液比(質量體積比，以下同)對結球菊苣總黃酮提取率的影響.

1.2.5 總黃酮提取的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，將乙醇體積分數(shù)(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、料液比(D)作為試驗因素進行正交設計，因素水平表見表1.

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factors level table

1.2.6 驗證實驗

稱取結球菊苣粉末10 g，平行3份，在1.2.5所得最佳提取工藝條件下提取結球菊苣中的總黃酮，計算提取率.

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

以吸光度(y)為縱坐標，蘆丁質量濃度(x)為橫坐標畫出標準曲線，結果見圖1.對不同質量濃度的蘆丁標準品溶液，由小到大，分別測吸光度.線性回歸得到吸光度與質量濃度關系式：

y=1.249 0x-0.006 9，R2=0.999 5.

圖1 標準蘆丁曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2 總黃酮提取率的單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

準確稱量5份結球菊苣葉粉末，以1∶20的料液比例，依次加入體積分數(shù)為30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %的乙醇，80 ℃恒溫水浴回流2 h，趁熱過濾，濃縮，測吸光度，計算黃酮含量，得乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響，結果見圖2.

圖2 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響Fig.2 The influence of ethanol concentration of flavonoids extraction yield

由圖2可知：乙醇體積分數(shù)在70 %以后開始波動，在70 %處出現(xiàn)最大值，當乙醇體積分數(shù)偏低或偏高時，黃酮提取率均有所降低.這是由于中等體積分數(shù)的乙醇水溶液的極性同結球菊苣中黃酮的極性相近，故黃酮可以更好地溶解析出；低體積分數(shù)的乙醇水溶液的極性會比較大，故雜質比較容易溶解，雜質含量升高，所得的黃酮提取率就較低[13]；體積分數(shù)大的乙醇水溶液吸水性強，極性小，改變了細胞的溶脹，故而黃酮提取率降低[14].

2.2.2 提取時間對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)為70 %、提取溫度80 ℃、料液比1∶20條件下，提取時間分別為1、2、3、4、5 h，研究提取時間對總黃酮提取率的影響，結果見圖3.

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.3 The influence of extraction time on flavonoids extraction yield

由圖3可知：提取時間4 h效果最好；開始時隨著時間的延長，黃酮類物質溶解的越來越多，提取率升高；后來隨著時間過長，提取率反而下降.這可能是由于提取過程中，時間的增加會引起乙醇揮發(fā)；此外，長時間的水浴加熱也可能改變結球菊苣葉中黃酮類化合物的活性成分結構，從而穩(wěn)定性降低，影響提取率[15].

2.2.3 提取溫度對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)70 %、料液比1∶20、水浴回流4 h的條件下，研究提取溫度對總黃酮提取率的影響，結果見圖4.由圖4可知：在60、70、80 ℃時，溫度對提取率的影響達到峰值，且基本穩(wěn)定.這主要是因為溫度升高溶解度增大，溫度再升高，提取率反而降低.

圖4 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 The influence of extraction temperature on flavonoids extraction yield

2.2.4 料液比對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)70 %、提取溫度70 ℃、恒溫水浴回流4 h的條件下，研究料液比對總黃酮提取率的影響，結果見圖5.由圖5可知：當料液比為1∶40時提取率最高，提取效果最好.

圖5 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.5 The influence of material liquid ratio on flavonoids extraction yield

2.3 正交試驗結果

按照表1進行正交試驗，試驗結果見表2.

由表2可知：乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度、料液比4個因素對結球菊苣葉總黃酮提取率的影響順序為提取溫度(C)>料液比(D)>乙醇體積分數(shù)(A)>提取時間(B).方差分析結果見表3，由表3可知：提取溫度(C)對黃酮提取率有顯著影響，而乙醇體積分數(shù)(A)、提取時間(B)、料液比(D)對提取率影響不大.最優(yōu)水平搭配為A1B3C1D3，即料液比1∶45，乙醇體積分數(shù)60 %，60 ℃加熱回流提取4 h.

表2 正交試驗設計及結果Table 2 The orthogonal experiment design and result

表3 總黃酮提取率方差分析Table 3 Flavonoids extraction yield anova table

2.4 優(yōu)化工藝驗證實驗

取3份結球菊苣粉末，每份10 g，按上述最優(yōu)提取工藝條件進行驗證實驗，測得平均總黃酮提取率為4.11 %.

3 結 論

以結球菊苣總黃酮的提取率為考察分析指標，采用乙醇加熱回流法提取結球菊苣中的總黃酮，通過對乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度、料液比進行單因素試驗和正交試驗，優(yōu)選出結球菊苣總黃酮提取的最佳工藝條件，即乙醇體積分數(shù)為60 %、提取時間4 h、提取溫度60 ℃、料液比1∶45.在所選最佳工藝條件下，進行驗證實驗，平均提取率為4.11 %.