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    養(yǎng)心氏片對心力衰竭大鼠心肌凋亡的影響

    2018-07-25 05:10:36郭志剛于春霞宋新旗
    中國老年學雜志 2018年12期
    關鍵詞:氏片養(yǎng)心心肌細胞

    郭志剛 于春霞 宋新旗

    (黃河科技學院,河南 鄭州 450063)

    研究表明,心肌細胞凋亡是導致心力衰竭發(fā)生與發(fā)展的重要病理基礎,心力衰竭的心肌細胞與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的活動密切相關〔1,2〕。連接蛋白(Cx)43是構(gòu)成心肌細胞間縫連接通道,在心肌細胞膜上Cx43存去磷酸化和磷酸化兩種狀態(tài),有效調(diào)控細胞間縫連接〔3〕。有研究顯示,在心力衰竭患者心肌細胞中Cx43磷酸化(P-Cx43)水平異常升高,關閉細胞間縫連接,增強Cx43降解,進而影響細胞間信號轉(zhuǎn)導〔4〕。養(yǎng)心氏片由人參、黃芪、靈芝、淫羊藿、當歸、山楂、丹參、延胡索、地黃、葛根、灸甘草、黃連組成,有化瘀止痛、益氣活血的功效,其組方強調(diào)以通為養(yǎng)、以補為養(yǎng)、以安為養(yǎng),是重要的中成藥制劑〔5,6〕。本研究分析養(yǎng)心氏片對心力衰竭大鼠心肌凋亡的影響及其機制。

    1 資料與方法

    1.1藥物 鹽酸阿霉素(RD7121,德國Ruibio),使用生理鹽水溶解,劑量為2 mg/kg。地高辛片(H31020678,上海信誼藥業(yè)),用生理鹽水溶解,劑量為0.02 mg/kg。養(yǎng)心氏片(080501,青島國風藥業(yè)),用蒸餾水配制,劑量為37.5 mg/kg。

    1.2試劑與儀器 本研究中使用倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)(奧林巴斯)、Medlab-U/8c生物信號采集分析系統(tǒng)(美易)、DYY-7C型電泳儀(六一儀器廠)、Model-680型酶標儀(BIO-BAD)、微量臺式離心機(BECKMAN)、紫外可見分光光度計(UV-3200PCS)、Masson三色染色液(Leagene)、腦鈉肽(BNP)酶聯(lián)免疫試劑盒(博美生物)、Rabbit-Anti-GAPDH(博美生物)、山羊抗兔抗體(H+L)(博美生物)、白細胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(博美生物)、肌鈣蛋白(cTn)I酶聯(lián)免疫試劑盒(博美生物)、TUNEL細胞凋亡試劑盒(碧云天),其余試劑均為分析純。

    1.3動物及分組 SD大鼠購自南京青龍山實驗動物中心,體質(zhì)量(200±20)g,大鼠均適應性喂養(yǎng)1 w。將所有大鼠隨機分為正常對照組(空白組)、模型組、養(yǎng)心氏片組、地高辛組,每組6只。模型組每周相同時間點注射一次阿霉素,濃度為2 mg/kg,持續(xù)干預6 w。養(yǎng)心氏片組、地高辛組均采用模型組方式進行造模,造模3 w后每日相同時間點給藥。養(yǎng)心氏片組大鼠灌胃給藥,給藥濃度37.5 mg/kg,地高辛組大鼠灌胃給藥,給藥濃度0.02 mg/kg。其余組灌胃等體積生理鹽水。

    1.4樣本制備及心功能檢測 本組研究中,利用生物信號系統(tǒng)在6 w后檢測大鼠心率(HR)、左室舒張期末壓(LVEDP)、左室峰壓(LVSP)、左室內(nèi)壓變化速率(dp/dtmax),檢測時穩(wěn)定15 min,并記錄0.5 h。再記錄完成后,頸總動脈取血,3 000 r/min離心10 min,后-80℃分裝保存,用于檢測生化指標。取大鼠心臟并稱重,計算大鼠心重/體重(HW/BW)比值,暴露心室心底部及心尖部,其中心底部使用多聚甲醛固定,用Masson染色觀察膠原纖維增生及形態(tài)學情況,使用Western印跡檢測心尖部P-Cx43及β-actin水平,所有過程嚴格遵照試劑盒說明書進行操作。

    1.5心肌細胞凋亡檢測 利用TUNEL檢測試劑盒檢測大鼠心肌組織凋亡細胞。光學顯微鏡下凋亡細胞細胞核呈黃色(陽性),正常細胞呈藍色(陰性)。每只大鼠隨機選取4張切片,400倍光學顯微鏡下每張切片觀察5個視野,計算凋亡細胞占比,取其均值作為心肌細胞凋亡指數(shù)(AI)。

    1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件,采用單因素方差分析多組數(shù)據(jù),使用S-N-K法行兩兩比較,Pearson法單因素直線回歸分析變量間相關性,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1大鼠血流動力學變化 模型組LVEDP水平顯著高于空白組(P<0.05),HR、LVSP、dp/dtmax水平明顯低于空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),地高辛組及養(yǎng)心氏片組大鼠LVEDP水平均顯著低于模型組(P<0.05),HR、LVSP、dp/dtmax水平明顯高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),養(yǎng)心氏片組大鼠LVEDP水平顯著低于地高辛組(P<0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠血流動力學結(jié)果

    與空白組比較:1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.05;與地高辛組比較:3)P<0.05,下表同

    2.2大鼠血中炎癥因子及HW/BW水平 模型組BNP、cTnI、IL-6、TNF-α、HW/BW均顯著高于空白組(P<0.05),地高辛組及養(yǎng)心氏片組BNP、cTnⅠ、IL-6、TNF-α、HW/BW均顯著低于模型組(P<0.05),養(yǎng)心氏片組大鼠BNP水平顯著高于地高辛組(P<0.05)。見表2。

    表2 大鼠血中炎癥因子及HW/BW水平檢測結(jié)果

    2.3心肌膠原纖維檢測結(jié)果 模型組大鼠心肌細胞膠原容積分數(shù)及AI顯著高于空白組(P<0.05),地高辛組及養(yǎng)心氏片組大鼠心肌細胞膠原容積分數(shù)及AI顯著低于模型組(P<0.05)。見表3。

    表3 心肌膠原纖維及心肌細胞凋亡結(jié)果

    2.4左心室P-Cx43表達 模型組大鼠P-Cx43/β-actin水平顯著高于空白組(P<0.05),地高辛組及養(yǎng)心氏片組大鼠P-Cx43/β-actin水平明顯低于空白組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

    2.5心肌細胞凋亡程度與P-Cx43水平的相關性 Pearson線性分析結(jié)果顯示,P-Cx43/β-actin水平與大鼠心肌細胞凋亡呈顯著正相關關系(P<0.05)。見圖2。

    圖1 P-Cx43水平檢測結(jié)果

    圖2 心肌細胞凋亡程度與P-Cx43水平相關性

    3 討 論

    心力衰竭的臨床發(fā)病機制復雜,神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心室重構(gòu)、體液因子等均與心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展密切相關〔7〕。BNP是體內(nèi)重要的肽類激素,左心室心肌細胞是BNP合成與分泌的主要細胞〔8〕。有研究指出,當心功能異常出現(xiàn)衰竭后,BNP在血漿中的水平異常升高〔9〕。cTn在骨骼肌及心肌中廣泛存在,其包含三種亞型,具有不同的蛋白結(jié)構(gòu)并由不同基因編碼,cTnI亞型屬于是心肌細胞特有,具有高度特異性,可作為評估心肌損傷的高特異性、高靈敏度的心肌損傷標志〔10〕。有研究指出,TNF-α在心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展過程中起到十分重要的作用,可作為預測心力衰竭的獨立因子〔11〕。在心力衰竭過程中,TNF-α可能參與血管擴張、心肌抑制、心肌纖維化及左室重構(gòu)等諸多病理過程中。有研究顯示,在心力衰竭患者血中IL-6表達水平顯著增加,且心力衰竭嚴重程度與IL-6表達水平密切相關〔12〕。

    程序性細胞死亡又稱為細胞凋亡,指在基因嚴格調(diào)控下的細胞主動性死亡過程〔13〕。雖然半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族史調(diào)控細胞凋亡的重要蛋白,而有學者指出在心肌細胞凋亡過程中,P-Cx的異常升高與之密切相關,P-Cx在心肌細胞間的化學信息交流及電耦聯(lián)過程中起到十分重要的作用〔14〕。在心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展過程中,心肌細胞的凋亡起到十分重要的作用。在評價心功能指標中,dp/dtmax及LVSP是重要的指標,可有效評估心肌收縮功能,其值與心肌收縮功能呈正相關關系,LVEDP是有效評估心室泵血的前負荷的重要指標,心肌舒張功能與LVEDP值呈明顯負相關關系〔15〕。

    本組研究表明,心力衰竭大鼠LVSP、dp/dtmax水平顯著降低,LVEDP水平顯著升高,提示心肌舒張及收縮功能顯著降低。此外,心力衰竭大鼠HW/BW及血漿中cTnⅠ、BNP、IL-6、TNF-α水平均顯著升高。Masson染色結(jié)果顯示,心力衰竭大鼠可見明顯的心肌細胞受損,心肌細胞膠原容積分數(shù)增高。TUNEL染色結(jié)果,心力衰竭大鼠的心肌細胞陽性細胞核明顯增高,左心室心肌組織中P-Cx43水平也呈明顯升高狀態(tài),且心肌細胞凋亡與P-Cx43表達水平呈正相關。與心力衰竭組相比,地高辛組及養(yǎng)心氏片組大鼠心臟LVSP、LVEDP及dp/dtmax水平均顯著改善,且HW/BW及血漿中cTnI、BNP、IL-6、TNF-α水平也得以明顯改善。深入分析左心室心肌組織P-Cx43的表達情況,結(jié)果顯示左心室心肌P-Cx43的表達也顯著降低,其結(jié)果與心肌細胞凋亡結(jié)果一致。

    綜上所述,養(yǎng)心氏片對可通過調(diào)控P-Cx43的表達而改善心力衰竭大鼠的心肌凋亡,并提高大鼠心功能,減輕心肌細胞纖維化及心室重構(gòu)。

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