Fgl2基因對H9C2心肌細胞凋亡的影響探討

肖懿峰　袁逸銘

【摘 要】目的：分析Fgl2基因對H9C2心肌細胞凋亡的影響與機制。方法：利用空白試劑、陰性病毒以及Fgl2siRNA慢病毒對H9C2心肌細胞進行感染。將其分為空白對照組、陰性對照組以及Fgl2siRNA組，然后經(jīng)過48小時后，利用Wsetern印跡對各組細胞內(nèi)的Fgl2蛋白表達進行檢測；對酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表達進行檢測；利用流式細胞術對細胞的凋亡情況進行檢測。結果：空白對照組與陰性對照組的Fgl2蛋白表達不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05），而Fgl2siRNA組的Fgl2蛋白表達與空白對照組相比具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；酶切caspase3的蛋白表達下降，Notch1以及Hesl的蛋白表達上升，都具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Fgl2組的H9C2細胞凋亡降低趨勢較為明顯，具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結論：Fgl2基因對H9C2心肌細胞的凋亡具有明顯抑制作用，而其機制與下調(diào)酶切caspase3蛋白表達以及激活Notch1信號通路有關。

【關鍵詞】Fgl2基因；心肌細胞；凋亡影響；纖維蛋白原樣

【中圖分類號】R542.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783（2018）06-03--01

經(jīng)過相關的醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，心肌疾病中都會出現(xiàn)心肌細胞凋亡，而心肌細胞凋亡會引起各種慢性心力衰竭、心室重塑等病癥。因此，抑制心肌細胞凋亡對心肌疾病具有一定的預防效果。對心肌細胞凋亡進行抑制可以改善心肌生存環(huán)境，減輕心臟重塑，有助于心肌疾病的后續(xù)治療。而Fgl2基因是一種纖維蛋白原樣，主要表達在T細胞、巨噬細胞以及內(nèi)皮細胞中，它是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要功能為調(diào)節(jié)免疫與凝血。

1 研究材料與研究方法

1.1 研究材料

此次試驗研究過程中主要使用的研究材料為H9C2心肌細胞株，是從中國科學院細胞庫中選購的。研究過程中使用的主要研究試劑包括：（1）RPMI1640培養(yǎng)基與胎牛血清；（2）陰性病毒、Fgl2 siRNA慢病；（3）二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒以及電化學發(fā)光（ECL）試劑盒；（4）細胞凋亡試劑盒、酶切caspase3、Notch1以及Hesl抗體。而研究中使用的儀器主要有：CO2細胞培養(yǎng)箱、流式細胞儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)以及聚丙烯酰胺凝膠電泳儀。

1.2 研究方法

研究過程包括細胞培養(yǎng)、細胞轉染以及效果檢測、細胞凋亡檢測、Wsetern印跡檢測酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表達。（1）細胞培養(yǎng)。取出心肌細胞凍存管放入37℃水中解凍，并要輕輕晃動凍存管，加速解凍過程。解凍完成后，將心肌細胞放在含有10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃、5%CO2以及飽和濕度為95%的恒溫培養(yǎng)箱。第二天更換培養(yǎng)液。按照實驗需要傳代，選取對數(shù)生長期的細胞進行研究。（2）細胞轉染及效果檢測。以1×105個/孔對生長至對數(shù)期的心肌細胞進行接種，使用的細胞培養(yǎng)板為6孔。細胞生長密度達到60%時，要及時更換培養(yǎng)基，對空白試劑組、陰性病毒組以及Fgl2 siRNA組對心肌細胞的感染程度進行檢測。取48小時后的細胞，向內(nèi)加入PMSF和RIPA裂解液，然后放在4℃冰上反應30分鐘，使用每分鐘12000轉的離心15分鐘，收集蛋白。用BCA試劑盒對蛋白進行定量。然后取出50微克蛋白樣品使用12%十二烷基硫酸與聚丙烯酰胺凝膠電泳儀進行分離，電泳結束后使用PVDF轉膜、5%脫脂奶粉進行封閉，加入一抗（1：400稀釋的Fgl2和1：1000稀釋的GAPDH），放置于4℃環(huán)境中孵育。第二天用TBST洗膜（3次，每次5分鐘），然后加入1：1000稀釋的辣根過氧化物酶標記過的羊抗鼠IgG，在室溫中孵育1小時，再次進行TBST洗膜，利用ECL化學發(fā)光劑顯色，在室溫避光環(huán)境中完成顯影與定影。以GAPDH為參照，對Fgl2的蛋白表達水平進行對比分析。（3）細胞凋亡檢測。主要利用流式細胞術對細胞凋亡情況進行檢測，然后對心肌細胞的凋亡率進行計算分析。（4）Wsetern印跡檢測酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表達。取出經(jīng)過轉染培養(yǎng)的各組細胞，利用BCA試劑盒對蛋白濃度進行檢測，然后檢測酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表達。

2 研究結果

使用SPSS21.0軟件對研究資料進行差異比較，兩組比較結果用t檢驗。此次研究中，空白對照組、陰性病毒對照組以及Fgl2 siRNA組的結果分別為：（1）Fgl2蛋白表達水平?？瞻讓φ战M與陰性病毒組的蛋白表達為[（0.445±0.051）VS（0.442±0.050）]，差異不具有統(tǒng)計學意義；而Fgl2 siRNA組的蛋白表達水平為（0.182±0.028），明顯低于空白對照組與陰性病毒組，具有統(tǒng)計學意義。（2）心肌細胞凋亡情況。空白對照組與陰性病毒組的細胞凋亡分別為[（1.25±0.28）%]、[（1.24±0.29）%]，而Fgl2 siRNA組的細胞凋亡為[（5.76±0.57）%]，降低趨勢明顯。（3）酶切easpase3，Noteh1，Hesl蛋白表達情況。Fgl2 siRNA組的酶切easpase3蛋白明顯下調(diào)表達，而Notchl，Hesl蛋白明顯上升。

3 結論

一直以來心血管疾病都是威脅人類健康的重要疾病，而患者在發(fā)病過程中因心肌缺血缺氧導致心肌細胞凋亡、心室擴張、心臟重塑等癥，最終導致患者心力衰竭。本次研究顯示，沉默F(xiàn)gl2表達可以明顯降低H9C2細胞的凋亡。而caspase家族是細胞凋亡的重要通路，其中caspase3是多種凋亡刺激信號的最終匯集點，它的活性是細胞凋亡進行不可逆階段的標志，根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)easpase3表達能夠降低心肌細胞的凋亡。所以，沉默F(xiàn)gl2表達可以借助抑制酶切easpase3表達實現(xiàn)降低心肌細胞凋亡的目的。而Fgl2表達激活Notch1信號通路，可以限制心肌細胞的凋亡，為治療心血管疾病提供理論基礎。

參考文獻

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