養(yǎng)殖大菱鲆紅斑潰瘍病病原菌的生物學(xué)特性研究

郭羿，葉仕根，王詩(shī)瑤，邢震宇，荊笛，高東旭，黎睿君，劉娟

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連市海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

大菱鲆Scophthalmusmaximus隸屬于鰈形目Pleuronectoidei、菱鲆科Scophthalmidae、瘤棘鲆屬Psetta，其具有耐低溫、無攻擊力、生長(zhǎng)快、抗逆性較強(qiáng)、味道鮮美等特點(diǎn)，是歐洲主要海水養(yǎng)殖魚類[1]。20世紀(jì)90年代初，中國(guó)從英國(guó)引入大菱鲆，養(yǎng)殖范圍從山東傳播至北方沿海各省，現(xiàn)已成為中國(guó)的一個(gè)重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[2]。近年來，隨著大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，其病害問題越來越突出，特別是微生物性疾病十分常見。根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道，可以將大菱鲆微生物性疾病分為三大類：病毒性疾病、細(xì)菌性疾病和寄生蟲疾病[1]。其中細(xì)菌性疾病主要有鏈球菌病、弧菌病、氣單胞菌病、沙雷氏菌病和分枝桿菌病[3]。

殺鮭氣單胞菌隸屬于氣單胞菌屬Aeromonas，是革蘭氏陰性短桿菌[4]，于1984年首次分離自一條患病的溪鱒Salvelinusfontinalis[5]。該菌主要包括無色亞種achromogenes、殺鮭亞種salmonicida、殺日本鮭亞種masoucida、史氏亞種smith和溶果膠亞種pectinolytica等5個(gè)亞種[6]。殺鮭氣單胞菌是魚類潰瘍病的主要致病菌，在感染初期，魚體軀干的局部皮膚及肌肉組織發(fā)炎，生出一個(gè)或幾個(gè)與人類癤瘡病相似的膿瘡[7]；隨著病灶內(nèi)細(xì)菌繁殖數(shù)量增多，皮膚和肌肉發(fā)炎，化膿形成膿瘡，患病部位軟化，向外隆起，隆起的皮膚先充血后出血、壞死和潰爛，嚴(yán)重時(shí)露出骨骼[8]。魚體發(fā)病部位不定，通常在魚體背鰭基部附近的兩側(cè)[9]。隨著殺鮭氣單胞菌的變異和進(jìn)化，其可感染的宿主范圍也在逐漸擴(kuò)大，已由最初的鮭科Salmonidae魚類擴(kuò)大到鯉科Cyprinidae、鲆科Bothidae和鰻鱺科Anguillidae魚類，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。

2016年6月，遼寧省葫蘆島市等地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆出現(xiàn)死亡，病魚早期癥狀是鰓蓋出血、鰭腐爛、體表出現(xiàn)含有膿血的潰瘍，養(yǎng)殖水溫為15 ℃。為此，本研究中從病魚中分離純化出優(yōu)勢(shì)菌株，并進(jìn)行了人工感染試驗(yàn)、生理生化特征檢測(cè)、16S rDNA測(cè)序和藥物敏感性試驗(yàn)，以期為養(yǎng)殖大菱鲆紅斑潰瘍病的病原鑒定及其防治等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 患病大菱鲆取自遼寧省葫蘆島市某養(yǎng)殖場(chǎng)，優(yōu)勢(shì)菌分離自病魚肝臟、腎臟、脾臟和潰瘍處。人工感染試驗(yàn)用健康大菱鲆購(gòu)自大連天正養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)為10～15 cm，飼養(yǎng)在40 L的塑料箱中，用氣石充氣，注射試驗(yàn)前暫養(yǎng)3 d。在暫養(yǎng)和正式試驗(yàn)過程中，試驗(yàn)魚食物充足，每?jī)商鞊Q水1次，每次換2/3水體。

1.1.2 試劑藥品 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；革蘭染色液和細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)于杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與人工感染試驗(yàn)

(1)病原菌的分離。將患有紅斑潰瘍癥的大菱鲆置于解剖盤中，用75%酒精擦拭體表，以無菌操作方式取潰瘍處、肝臟、脾臟和腎臟等組織，劃線接種到含2.5% NaCl的TSA培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。挑取單菌落進(jìn)一步劃線純化，將獲得的純培養(yǎng)置于20%的甘油-營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)人工感染試驗(yàn)。注射感染試驗(yàn)：用0.9%無菌生理鹽水將純化培養(yǎng)的HLD01制成菌懸液，并進(jìn)行梯度稀釋，共設(shè)置5.37×106、5.37×107、5.37×108、5.37×109CFU/mL 4個(gè)濃度組，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，每組10尾魚。4個(gè)濃度組以腹腔注射法人工感染大菱鲆，每尾魚注射200 μL相應(yīng)濃度的菌懸液，對(duì)照組魚注射200 μL 0.9%無菌生理鹽水，每天觀察記錄各組大菱鲆發(fā)病及死亡情況。

浸泡感染試驗(yàn)：用0.9%無菌生理鹽水將純化培養(yǎng)的HLD01制成菌懸液，并進(jìn)行梯度稀釋，共設(shè)置1.5×104、1.5×105、1.5×106CFU/mL 3個(gè)濃度海水組，并設(shè)立對(duì)照組，每組放入8尾大菱鲆。將試驗(yàn)大菱鲆的背部用無菌刀片割傷，切割的長(zhǎng)度和深度盡量保持一致，對(duì)照組海水中不添加菌液，每天觀察記錄各組大菱鲆發(fā)病及死亡情況。

根據(jù)改良寇氏法[11]分別計(jì)算HLD01在注射感染試驗(yàn)和浸泡感染試驗(yàn)中的半致死劑量LD50。在無菌條件下，對(duì)具有與自然發(fā)病大菱鲆相似癥狀的人工感染大菱鲆進(jìn)行細(xì)菌分離，若分離得到的細(xì)菌與人工感染試驗(yàn)所用的菌株各方面特征相同，則說明分離到的細(xì)菌是病原菌。

1.2.2 病原菌的鑒定

(1)形態(tài)特征觀察。肉眼觀察培養(yǎng)24 h后的菌落，對(duì)其大小、顏色等特征進(jìn)行測(cè)量和記錄。參照革蘭染色液說明書對(duì)優(yōu)勢(shì)菌HLD01進(jìn)行染色并鏡檢。

(2)生理生化特征測(cè)定。挑取適量培養(yǎng)于含2.5% NaCl的TSA培養(yǎng)基中的待測(cè)菌落(培養(yǎng)溫度為28 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為24 h)置于生理生化反應(yīng)管中，并置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察生理生化管顏色等特征變化，參照各生理生化指標(biāo)說明書對(duì)優(yōu)勢(shì)菌HLD01進(jìn)行生理生化特征測(cè)定，并與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]進(jìn)行比對(duì)。

(3)16S rDNA基因序列測(cè)定。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取優(yōu)勢(shì)菌HLD01的DNA，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物(正向引物F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′；反向引物R：5′TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3′)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系(共25 μL)：10×buffer 2.5 μL，dNTP(25 mmol/L)2 μL，Taq DNA Polymerase 0.13 μL，模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 18.37 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min 30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃下再延伸10 min。

PCR產(chǎn)物由北京華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，在NCBI網(wǎng)站用Blast軟件進(jìn)行同源性比對(duì)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)，從Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中選取10條與HLD01相近的細(xì)菌序列，利用MEGA4.0軟件[13]的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹分支置信度用 1000 次重復(fù)自舉檢驗(yàn)，在計(jì)算過程中，系統(tǒng)自動(dòng)省略不確定和缺失的位點(diǎn)。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 用0.9%無菌生理鹽水將培養(yǎng)36 h的HLD01制成終濃度為1.0×107CFU/mL的菌懸液，取100 μL涂布于含2.5% NaCl的TSA培養(yǎng)基上，將抗生素紙片(購(gòu)于杭州濱和微生物試劑有限公司)貼于培養(yǎng)基表面，每個(gè)平板貼4片，共計(jì)20片。將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄藥敏紙片周圍抑菌圈直徑。根據(jù)CLSI評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[14]對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 病原菌的分離 從患病大菱鲆各組織器官中均分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌落，將其命名為HLD01。HLD01菌在含2.5%NaCl的TSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，呈乳白色，圓形，直徑為(0.6±0.1)mm，表面濕潤(rùn)、光滑。

2.1.2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果 菌株HLD01通過腹腔注射和劃傷浸泡兩種方式感染大菱鲆，結(jié)果顯示，該菌株對(duì)大菱鲆有較強(qiáng)致病力(表1)。HLD01通過腹腔注射法感染大菱鲆的LD50為8.4×107CFU/mL，95%可信限為(3.2×107～ 2.3×108)CFU/mL；通過劃傷浸泡法感染大菱鲆的LD50為6.3×104CFU/mL，95%可信限為(5.6×104～ 7.1×104)CFU/mL。自然發(fā)病的大菱鲆如圖1所示。試驗(yàn)中人工感染患病大菱鲆與自然發(fā)病的大菱鲆癥狀大致相同，均表現(xiàn)為體表黏液增多、體表有大小不一的潰瘍?cè)?、腹部腫脹和肝臟貧血(圖2)。從瀕死的人工感染患病大菱鲆體內(nèi)也分離得到HLD01菌，證明該菌株為此次大菱鲆紅斑潰瘍癥的病原菌。

表1 人工感染大菱鲆的試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of artificially challenged turbot with HLD01 injection

注：紅色箭頭示體表潰瘍處Note:Red arrows show the ulcer on the body surface圖1 自然發(fā)病大菱鲆的體表癥狀Fig.1 Surface symptoms of the diseased turbot with natural morbidity

注：紅色箭頭示體表潰瘍處Note:Red arrows show the ulcer on the body surface圖2 人工感染大菱鲆的體表癥狀Fig.2 Surface symptoms of turbot challenged by infection

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 HLD01菌在含2.5%NaCl的TSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈乳白色，圓形，直徑為(0.6±0.1) mm，表面濕潤(rùn)、光滑。

經(jīng)過革蘭氏染色和顯微鏡觀察(OLYMPUS CX21)，該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，有莢膜，無芽孢和鞭毛，大多單個(gè)分布，少數(shù)成對(duì)分布。

2.2.2 生理生化特征鑒定 菌株HLD01主要生理生化特征為對(duì)鳥氨酸脫羧酶陰性；硝酸鹽還原呈陽(yáng)性；能發(fā)酵麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和D-葡萄糖產(chǎn)酸；不能發(fā)酵阿拉伯糖醇、阿拉伯糖、肌醇、棉籽糖、木糖、半乳糖、阿東醇產(chǎn)酸；不能發(fā)酵D-葡萄糖產(chǎn)氣；不產(chǎn)生硫化氫(表2)。通過對(duì)比3種殺鮭氣單胞菌亞種的生理生化指標(biāo)，最終將HLD01確定為殺鮭氣單胞菌無色亞種。但是該分離株不能在0% NaCl的環(huán)境下生長(zhǎng)(表2)，與殺鮭氣單胞菌無色亞種的生理生化指標(biāo)稍有偏差。

2.2.3 16S rDNA基因序列分析 菌株HLD01經(jīng)16S rDNA通用引物擴(kuò)增后得到的基因片段長(zhǎng)度為1412 bp， Blast分析結(jié)果表明，其與殺鮭氣單胞菌的同源性最高，達(dá)100%。從NCBI上的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中選取10株與HLD01相近的序列，經(jīng)ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)后，利用MEGA 4.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2HLD01菌的生理生化特性分析

Tab.2PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofHLD01

鑒定項(xiàng)目characteristic item菌株HLD01無色亞種殺日本鮭亞種殺鮭亞種肌醇 inositol----木糖 xylose----蔗糖 sucrose+++-木醇 methanol-NFNFNF硫化氫 H2S--+-阿東醇 adonitol----半乳糖 galactose----棉籽糖 raffinose----葡萄糖 glucose++++麥芽糖 maltose++++松二糖 turanose+NFNFNF松三糖 melizitose-NFNFNF阿拉伯糖 arabinose--++阿拉伯糖醇 arabinitol----硝酸鹽還原 nitrate reduction++++0%NaCl生長(zhǎng)growth at 0% NaCl -+++1%NaCl生長(zhǎng)growth at 1% NaCl ++++鳥氨酸脫羧酶 ornithine decarboxylase----D-葡萄糖產(chǎn)酸 decomposi-tion of D-glucose produces acid++++D-葡萄糖產(chǎn)氣 decomposi-tion of D-glucose produces gas--++

注：+為陽(yáng)性；-為陰性；NF為未知

Note:+,positive; -,negative; NF,unknown

由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，菌株HLD01與殺鮭氣單胞菌無色亞種聚為一支，且與殺鮭氣單胞菌其他亞種具有較近的親緣關(guān)系(圖3)。綜合16S rDNA序列分析結(jié)果和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)菌株HLD01為殺鮭氣單胞菌無色亞種。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株HLD01對(duì)慶大霉素、卡那霉素、菌必治、恩諾沙星等12種藥物高度敏感，對(duì)氧氟沙星中度敏感，對(duì)頭孢拉定、林可霉素和克林霉素等7種藥物不敏感(表3)。

表3 HLD01菌對(duì)20種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

注：S為高度敏感；M為中度敏感；R為不敏感

Note: S,high sensitive; M,medium sensitive; R,resistant

3 討論

3.1 殺鮭氣單胞菌的來源與分類

殺鮭氣單胞菌最早在1890年由Weible和Emmerich從患病鱒魚體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)[15]，其宿主范圍十分廣泛，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性病原菌[16]。根據(jù)吲哚產(chǎn)生、七葉苷利用，以及對(duì)半乳糖、蔗糖等碳水化合物的分解能力等生理生化差異[17]，將殺鮭氣單胞菌分為殺鮭亞種、史氏亞種、殺日本鮭亞種、溶果膠亞種和無色亞種5個(gè)亞種[6,18-19]。

本研究中從自然發(fā)病的大菱鲆潰瘍?cè)罴皟?nèi)臟中分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌HLD01，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA鑒定，證明本次大菱鲆紅斑潰瘍癥的病原菌為殺鮭氣單胞菌無色亞種。

3.2 殺鮭氣單胞菌的致病性

本研究中的人工感染試驗(yàn)表明，人工感染發(fā)病大菱鲆和自然發(fā)病大菱鲆均表現(xiàn)為口部和鰭部有出血點(diǎn)、腹部腫脹、肝臟發(fā)白、腸炎等癥狀，這與呂俊超等[20]報(bào)道的由殺鮭氣單胞菌感染大菱鲆的癥狀表現(xiàn)一致，但兩試驗(yàn)間也存在著一定的差異。本試驗(yàn)中，腹腔注射5.37×109CFU/mL劑量組的試驗(yàn)魚于注射后第二天全部死亡，其余劑量組的試驗(yàn)魚于注射后第三天開始陸續(xù)死亡，截至試驗(yàn)結(jié)束，5.37×106CFU/mL劑量組試驗(yàn)魚的死亡率僅為10%；而呂俊超等[20]報(bào)道的攻毒試驗(yàn)，每尾大菱鲆注射1.1×106CFU時(shí)，該組大菱鲆于2 h內(nèi)全部死亡。對(duì)比兩次試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，殺鮭氣單胞菌對(duì)大菱鲆具有一定的致病力，但致死能力有所下降。

圖3 基于HLD01和其他同源菌株的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences in strain HLD01 and other homologous bacterial strains

經(jīng)鑒定，從攻毒試驗(yàn)感染大菱鲆中分離到的細(xì)菌與HLD01菌在形態(tài)特征、16S rDNA基因序列測(cè)定和生理生化指標(biāo)等方面相一致，這符合科赫法則[21]，同時(shí)也再次證明，HLD01菌是本次大菱鲆紅斑潰瘍癥的病原菌。

3.3 殺鮭氣單胞菌的感染途徑

本研究中發(fā)現(xiàn)，患病魚體表出現(xiàn)紅斑潰瘍癥狀，且有其他研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，殺鮭氣單胞菌是虹鱒和刺參發(fā)生皮膚潰瘍癥狀的致病菌[22-23]，由此證實(shí)，該菌是引起魚類等水生生物皮膚潰瘍病的主要病原菌[24]。殺鮭氣單胞菌的感染途徑大致分為兩種：一種是細(xì)菌通過養(yǎng)殖水體進(jìn)行傳播，在大菱鲆攝食過程中隨著水和食物進(jìn)入消化系統(tǒng)并侵入血液導(dǎo)致敗血癥，致使皮膚和肌肉壞死潰爛[25]；另外一種是細(xì)菌從魚體創(chuàng)傷處進(jìn)入魚體內(nèi)，引起局部皮膚或肌肉組織發(fā)炎，進(jìn)而化膿、壞死、潰爛，形成紅斑潰瘍[26]。因此，在魚類養(yǎng)殖過程中，為了避免感染殺鮭氣單胞菌，應(yīng)隨時(shí)注意水質(zhì)，投喂優(yōu)質(zhì)餌料，降低養(yǎng)殖密度，減少魚類在運(yùn)輸過程中造成的機(jī)械損傷[27]。同時(shí)，由于細(xì)菌會(huì)隨著魚類排泄物在水中擴(kuò)散[28]，故要及時(shí)清理排泄物。

3.4 殺鮭氣單胞菌無色亞種的藥物防治

目前，大菱鲆潰瘍病的主要防治方法是遍灑抗生素。本試驗(yàn)中，經(jīng)20種抗生素紙片對(duì)HLD01菌的藥敏測(cè)定顯示，該菌對(duì)慶大霉素、頭孢吡肟、拉氧頭孢、頭孢他啶、卡那霉素、頭孢哌酮、強(qiáng)力霉素、菌必治、頭孢曲松、頭孢呋辛、恩諾沙星和多粘菌素B 12種藥物高度敏感，對(duì)頭孢拉定、氨芐西林、林可霉素、頭孢唑林、磺胺甲惡唑和克林霉素7種藥物耐藥。王亞冰等[29]研究表明，頭孢他啶、頭孢哌酮、強(qiáng)力霉素、頭孢曲松和頭孢呋辛藥物對(duì)殺鮭氣單胞菌無色亞種有較好的抑菌作用，與本研究結(jié)果相一致。根據(jù)本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果，可參考選取慶大霉素、頭孢吡肟、拉氧頭孢等藥物來治療和控制養(yǎng)殖大菱鲆潰瘍病。同時(shí)，為防止殺鮭氣單胞菌無色亞種對(duì)更多抗生素產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)科學(xué)用藥、對(duì)癥下藥，同時(shí)積極研發(fā)相關(guān)疫苗，以減少經(jīng)濟(jì)損失。