羊口瘡病毒榆林株B2L和F1L串聯(lián)基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)的表達

馮 平，李云章，孫豐廷，屈 雷，閆海龍

(1內蒙古農業(yè)大學 獸醫(yī)學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2榆林學院 生命科學學院，陜西 榆林 719000；3武漢中拓康明生物科技有限公司，湖北 武漢 430040)

羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)又稱為接觸傳染性膿皰皮炎病毒(Contagious pustular dermatitis virus，CPDV)，是人畜共患、接觸性、嗜上皮性傳染病羊口瘡的病原[1]。ORFV屬于痘病毒科脊索動物痘病毒亞科的副痘病毒屬，病毒粒子呈橢圓形，大小約260 nm×160 nm，外面包繞著螺旋絲狀結構，病毒粒子外常有囊膜包裹[2]。ORFV基因組龐大，約有135個基因Orf001-Orf135，其中Orf001-Orf008及Orf112-Orf135為末端反向重復序列區(qū)域，Orf009-Orf111為中央區(qū)基因組區(qū)域[3-4]。這些基因片段編碼多種不同的蛋白,主要有抗細胞凋亡蛋白、羊口瘡病毒干擾素抗性蛋白(Interferon resistance protein,IFNR)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、GM-CSF/IL-2(The inhibitor of granulocyte-macrophage colony stimulation factor/interleukin-2，GIF)、CEV-IL-10(A cytokine interleukin-10 orthologue,vIL-10)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、dUTPase 蛋白、 錨蛋白(ANK)重復蛋白、 趨化因子結合蛋白(Chemokine-binding protein，CBP)、42 ku 蛋白、39 ku 蛋白、10 ku 蛋白、DNA 聚合酶以及 RNA 聚合酶等[5-9]。目前，國內外學者對ORFV的研究主要集中在與病毒毒力、免疫調節(jié)以及免疫原性相關的蛋白方面，如與病毒毒力和免疫逃避有關的 IL-10和VEGF 等，與宿主免疫防御機制和免疫逃避有關的免疫調節(jié)蛋白OV_IFNR、GIF、vIL-10和VEGF等，以及能刺激機體產生強烈免疫反應且具有免疫原性的39和42 ku蛋白等[10-13]。

ORFV免疫反應以細胞免疫反應為主，但體液免疫反應也發(fā)揮著一定的作用[14-15]。42 ku蛋白由Orf011(B2L)基因編碼，又稱為B2L蛋白，是病毒表面囊膜的組成成分之一，能夠刺激機體產生強烈的體液免疫應答，同時還可引起淋巴細胞的增殖分化[16]，被廣泛應用于副痘病毒屬的實驗室檢測[17-18]。

39 ku蛋白又稱為F1L蛋白，由Orf059(F1L)基因編碼，F1L基因長1 005 bp，位于ORFV基因組比較保守的中部區(qū)域[19]。有研究證實，利用純化的不同ORFV毒株分別制備單克隆抗體，然后通過免疫熒光技術成功檢測到3種單克隆抗體均與病毒顆粒表面的囊膜特異性結合，而F1L蛋白和22 ku蛋白則是ORFV單克隆抗體的主要結合位點。蛋白免疫印跡試驗發(fā)現，利用ORFV制備的兔抗羊口瘡病毒多克隆血清，也能檢測到F1L蛋白和22 ku蛋白條帶，這表明F1L蛋白為免疫原性蛋白[20]。同時還有研究表明，宿主體液免疫產生的抗體主要與F1L蛋白結合，該蛋白是病毒表面微管的組成成分之一，能夠刺激宿主產生中和抗體，該結果進一步證實F1L蛋白是免疫原性蛋白[21]。此外，該蛋白能夠與表達于大多數哺乳動物細胞表面的硫酸乙酰肝素(HS)受體結合，在病毒吸附和侵入過程中起重要作用[12]。鑒于此蛋白的重要性，國內外學者對其高度關注，以期將其應用于基因工程疫苗的研制及疾病的診斷等方面。

目前，疫苗接種被認為是預防和控制該病可靠且有效的手段。國外已有羊口瘡弱毒疫苗，但我國市場上尚無口瘡弱毒疫苗供應。由于弱毒疫苗本身存在毒力返強、病毒擴散等缺陷。因此，研制使用簡單、方便、免疫效果確實的羊口瘡基因工程亞單位疫苗已成為防控羊口瘡疫病的必然趨勢。目前，ORFV的2種主要抗原基因B2L和F1L已經在不同的系統(tǒng)中獲得了單獨或共同表達，如原核系統(tǒng)和真核表達載體pCDNA3.1、pVAX1等[22-25]。此外，國內已經研發(fā)出B2L基因的重組菌，該重組菌可以傳代且高效表達B2L蛋白[26]。然而，原核系統(tǒng)表達的蛋白缺乏相關的翻譯后修飾，而目的蛋白在pCDNA3.1、pVAX1質粒中的表達具有水平低、費用高、操作復雜、周期長等缺點。

本課題組從陜西榆林發(fā)病的陜北白絨山羊病料中分離出ORFV-Yulin株，并在桿狀病毒表達系統(tǒng)中對其B2L全長基因進行了表達[27]，本研究擬進一步對ORFV-Yulin株的F1L全長基因進行擴增和序列分析，并采用桿狀病毒表達系統(tǒng)對B2L和F1L進行串聯(lián)表達，以期為羊口瘡基因工程亞單位疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 載體、菌株與主要試劑 MDBK細胞、昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)質粒pBac5、線性化的 Bacmid、陜北白絨山羊ORFV榆林株ORFV-YulinB2L基因T載體(pGT-B2L)，均由本實驗室保存；Top10大腸桿菌感受態(tài)細胞、預染蛋白Marker(CW0986M)、SDS-PAGE上樣緩沖液(CW0027A)，購自康為世紀生物科技有限公司；PCR 反應試劑、pGEM-Teasy載體、PrimeSTAR?HS高保真聚合酶、總DNA提取試劑盒、DNA Marker，均購自TaKaRa公司；質粒DNA小量制備試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，購自OMGA公司；細胞轉染試劑(Sofast，11103)，購自梭華公司；抗His-Tag Mouse(KM8001)、HRP標記的山羊抗鼠二抗(LK2003)，購自天津三箭生物科技有限公司;昆蟲細胞培養(yǎng)基SFX-Insect(SH30278.02)，購自HyClone。

1.1.2 引物設計 參照GenBank中登錄的ORFVF1L基因序列(GenBank登錄號KU199840.1)設計引物1F/1R，用于擴增F1L基因。根據B2L[27]和F1L的測序結果，分別設計串聯(lián)的桿狀病毒表達引物2F/2R和3F/3R，引物均由中美泰和公司合成，其序列見表1。

表1 本研究中所用到的引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used in this study

注：2F和3R序列中的下劃線部分分別是NheⅠ和HindⅢ酶切位點。

Note: The underlined in sequences of 2F and 3R represent the cleavage sitesNheⅠ andHindⅢ,respectively.

1.2 F1L全長基因的擴增

用總DNA提取試劑盒從ORFV-Yulin株轉染細胞中提取ORFV的DNA，以之為模板，用表1中的克隆引物1F/1R進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL：5×PrimeSTAR?Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTPs(25 mmol/L) 4 μL，引物1F和1R(25 pmol/μL)各1 μL，DNA模板4 μL，PrimeSTAR?HS高保真聚合酶0.5 μL，加ddH2O補足50 μL。擴增條件為:98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.3 F1L全長基因的遺傳變異分析

用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，將其與pGEM-Teasy載體連接后，轉化Top10大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑單菌落進行PCR鑒定(PCR反應程序同上)，提取陽性菌落質粒送中美泰和公司測序，將陽性質粒命名為pGT-F1L。從GenBank中選取其他15株ORFV毒株(表2)的F1L基因序列，利用DNAStar分析本試驗分離毒株與這15株參考毒株核苷酸和推導的氨基酸序列的相似性并構建遺傳進化樹。

1.4 融合基因rB2LcF1L的PCR擴增與pGT-rB2LcF1L的構建

分別以pGT-B2L和1.3中獲得的陽性質粒pGT-F1L為模板，用表1中的表達載體引物2F/2R和3F/3R,分別擴增B2L融合基因(rB2L)和F1L去掉編碼1-70位氨基酸信號肽的核苷酸融合基因(cF1L)，反應體系和程序同上。rB2L和cF1L融合基因的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收純化，送中美泰和公司測序后進行融合PCR擴增。

表2 本研究中用到的其他ORFV毒株信息Table 2 Information of ORFV strains used in this study

利用堿基linker連接，通過重疊PCR擴增獲得ORFV rB2L-linker-cF1L融合基因(rB2LcF1L)。融合PCR擴增體系為50 μL：5×PrimeSTAR?Buffer(Mg2+plus) 10 μL，dNTPs(25 mmol/L) 4 μL，rB2L和cF1L融合PCR模板各4 μL，PrimeSTAR?HS高保真聚合酶0.5 μL，加ddH2O補足50 μL。擴增程序為：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s ，10個循環(huán)。然后取1 μL前述 PCR產物作為第2次PCR的模板，以2F和3R為引物進行PCR擴增，反應體系為50 μL：5×PrimeSTAR?Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTPs(25 mmol/L) 4 μL，模板1 μL，引物2F、3R(25 pmol/μL)各1 μL， PrimeSTAR?HS高保真聚合酶0.5 μL，加ddH2O補足50 μL。擴增程序為：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s ，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

切膠回收rB2LcF1L基因，將其與pGEM-Teasy載體連接后，轉化Top10大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行PCR鑒定(反應體系和反應程序同第2次PCR)，提取陽性菌落質粒進行NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后，送中美泰和公司測序，將陽性質粒命名為pGT-rB2LcF1L。

1.5 rB2LcF1L在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達

1.5.1 昆蟲桿狀病毒表達載體pBac-rB2LcF1L的構建 將pGT-rB2LcF1L和桿狀病毒表達載體pBac5分別用NheⅠ和HindⅢ雙酶切后連接，均轉化Top10大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行PCR鑒定(反應體系和反應程序同1.4節(jié)第2次PCR擴增)，提取陽性菌落質粒進行NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，將鑒定正確的質粒送中美泰和公司測序。將陽性質粒命名為pBac-rB2LcF1L。

1.5.2 昆蟲桿狀病毒的包裝 取6孔細胞培養(yǎng)板，以1×106mL-1的細胞密度接種生長狀態(tài)良好的sf9細胞，置于27 ℃培養(yǎng)2 h，待細胞的融合度達到80%左右時進行轉染。用100 μL無血清培養(yǎng)基將3 μg pBac-rB2LcF1L與3 μg線性化的 Bacmid混勻，作為溶液Ⅰ；用100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋5 μL的梭華轉染試劑后，緩慢滴加到溶液Ⅰ中，混勻，靜置20 min。將混合液加入到上述接種了sf9的細胞板中，27 ℃孵育5～7 d，熒光顯微鏡下觀察報告基因cGFP的表達情況，待病變細胞達到90%以上后收獲細胞上清液于1 mL離心管中，標注為P1代重組桿狀病毒，-80 ℃長期保存。

1.5.3 B2L和F1L重組蛋白在sf9細胞中的表達與驗證 將sf9細胞按照2.5×106mL-1的細胞總數鋪入T25方瓶，待細胞貼壁2 h后，用1 mL注射器將100 μL P1代病毒盲接到T25方瓶中，培養(yǎng)5～7 d，觀察熒光，收取細胞上清液和細胞樣品備用。向細胞樣品中加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴5～10 min后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液。對細胞上清液和細胞處理后的樣品，用12%的SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況。切取凝膠上的目的蛋白條帶，送華大基因公司進行質譜鑒定。與此同時，將上述樣品經SDS-PAGE電泳后轉印至硝酸纖維素膜(NC膜)上，分別以His標簽抗體為一抗、HRP標記的山羊抗鼠IgG為二抗進行孵育，用ECL顯色液進行顯色，最后在化學發(fā)光儀中曝光。

2 結果與分析

2.1 F1L全長基因的PCR擴增及序列分析

瓊脂糖凝膠電泳結果(圖1)顯示，擴增產物條帶長度為1 029 bp左右，與預期結果相符。序列分析結果顯示，ORFV-Yulin株的F1L高度保守，與表2中15株參比毒株核苷酸的相似性為96.7%～99.0%，氨基酸的相似性為96.1%～99.4%，其中與ORFV FJ-MH2015株F1L序列核苷酸和氨基酸的相似性最高，分別為99.0%和99.4%。F1L基因的遺傳進化分析結果(圖2)顯示，該毒株與參考毒株XP(KM675408.1)、FJ-MH2015(KU199840.1)以及Shanxi(HQ221964.1)株處于同一進化分支上。

M．DL5000 DNA Marker；1.F1L基因全長擴增產物M．DL5000 DNA Marker；1.Amplification product of full-length F1L gene圖1 ORFV-Yulin株F1L基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of F1L of ORFV-Yulin

圖2 ORFV-Yulin株F1L基因的遺傳進化分析Fig.2 Phylogenetic tree according to F1L gene of ORFV-Yulin

2.2 rB2LcF1L融合基因的擴增

2.2.1 cF1L融合基因的擴增 由圖3可知，cF1L擴增獲得了855 bp的片段，與預期結果相符。將純化后的PCR產物送中美泰和公司測序，結果正確。

2.2.2 rB2L融合基因的擴增 圖4顯示，rB2L擴增獲得了1 180 bp的片段，與預期結果相符。將純化后的PCR產物送中美泰和公司測序，結果正確。

M．DL5000 DNA Marker；1.cF1L基因擴增產物M．DL5000 DNA Marker；1.Amplification product of cF1L gene

2.2.3 rB2LcF1L融合基因的擴增 利用2.2.1和2.2.2中獲得的PCR模板進行融合PCR，獲得目的片段(1 983 bp)后與pGEM-Teasy載體連接，獲得載體pGT-rB2LcF1L。對pGT-rB2LcF1L進行NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，結果獲得了3 000和1 983 bp的片段(圖5)，與預期結果相符。將該質粒送美泰和公司測序，結果正確。

M．DL5000 DNA Marker；1.質粒pGT-rB2LcF1LM．DL5000 DNA Marker；1.The plasmid pGT-rB2LcF1L圖5 pGT-rB2LcF1L的NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定Fig.5 Double digestion of pGT-rB2LcF1L with NheⅠ and HindⅢ

2.3 pBac-rB2LcF1L載體的鑒定

菌落PCR鑒定獲得了1 983 bp的片段(圖略)，與預期結果一致。pBac-rB2LcF1L載體經NheⅠ和HindⅢ雙酶切后獲得了6 640和1 983 bp的片段(圖6)，其長度與預期結果相符，質粒pBac-rB2LcF1L測序鑒定結果正確，表明pBac-rB2LcF1L載體構建成功。

M．DL5000 DNA Marker；1.質粒pBac-rB2LcF1LM．DL5000 DNA Marker；1.The plasmid named pBac-rB2LcF1L圖6 昆蟲桿狀病毒表達重組質粒pBac-rB2LcF1L的NheⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定Fig.6 Double digestion of recombinant baculovirus expression vector pBac-rB2LcF1L with NheⅠ and HindⅢ

2.4 rB2LcF1L融合蛋白在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達

2.4.1 表達rB2LcF1L的昆蟲桿狀病毒的包裝 將質粒pBac-rB2LcF1L轉染sf9細胞，27 ℃孵育5 d后即可觀察到報告基因cGFP的表達，細胞可見綠色熒光(圖7)，表明桿狀病毒包裝成功，獲得了表達rB2LcF1L融合蛋白的桿狀病毒。

圖7 表達融合蛋白rB2LcF1L的昆蟲桿狀病毒cGFP基因的表達(×200)Fig.7 Expression of cGFP in baculovirus expressing the rB2LcF1L protein of ORFV-Yulin (×200)

2.4.2 rB2LcF1L在sf9細胞中的表達 SDS-PAGE結果顯示，細胞培養(yǎng)上清、細胞樣品中均有1條明顯的條帶，分子質量約為80 ku(圖8)，表明融合蛋白rB2LcF1L在sf9細胞中得到了表達，且表達的蛋白有一部分可分泌到細胞外。

M.蛋白Marker；1.細胞上清；2.細胞沉淀M．Protein Marker;1.Cell supernatant；2.Cell precipitation圖8 ORFV-Yulin 株rB2LcF1L在sf9細胞中的表達Fig.8 Expression of rB2LcF1L of ORFV-Yulin in sf9 cells

Western blotting結果(圖9)和后續(xù)的譜鑒定結果均證實,B2LcF1L表達成功。

M.蛋白Marker；1.細胞上清；2.細胞沉淀M．Protein Marker;1.Cell supernatant；2.Cell precipitation圖9 ORFV-Yulin株rB2LcF1L在sf9細胞中表達的Western blotting鑒定Fig.9 Western blotting of rB2LcF1L of ORFV-Yulin in sf9 cells

3 討 論

李雯麗[28]對陜西省4個區(qū)/縣的白絨山羊和奶山羊主要養(yǎng)殖基地進行了口瘡病原的檢測和發(fā)病率調查，結果發(fā)現,檢出率最高的達82.6%，最低的也達到了24.1%，而且檢出率最高羊場發(fā)生過相當嚴重的羊口瘡疫情，導致大批量新生羔羊被淘汰，這說明陜西山羊口瘡病毒攜帶率和發(fā)病情況不容樂觀。本研究以本課題組前期從榆林市某白絨山羊場分離到的ORFV-Yulin株為研究對象，對其F1L的全長基因進行了克隆分析，發(fā)現ORFV-Yulin株的F1L與參考毒株FJ-MH2015(KU199840.1)、Shanxi(HQ221964.1)及XP(KM675408.1)F1L基因的相似度均高達99.0%，這表明羊口瘡病毒的F1L基因高度保守。系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析表明，ORFV-Yulin株與FJ-MH2015(KU199840.1)、Shanxi(HQ221964.1)以及XP(KM675408.1)株同屬于一個分支，而FJ-MH2015(KU199840.1)、Shanxi(HQ221964.1)以及XP(KM675408.1)等毒株的宿主均為山羊。綜上所述，本課題組從白絨山羊疑似病例分離到的毒株可能與近年來山羊的頻繁流動，既跨地區(qū)引種等因素有關。對F1L基因進行克隆和序列分析，有利于從分子水平上了解ORFV-Yulin株病毒，并且對白絨山羊種群中ORFV的流行病學調查、分子生物學研究及工程苗的研制和開發(fā)等具有重要意義。

由于ORFV具有免疫逃避機制，因此在動物感染該病毒后，機體無法獲得終身免疫力，而且容易引起繼發(fā)性感染。此外，由于羔羊免疫機制還未健全，因此尚不能通過注射疫苗的方式提高新生羔羊抵抗ORFV感染的能力，而母源特異性抗體的保護時間又較短，若ORF一旦流行，羔羊淘汰率勢必增加。現在國外臨床生產中應用的羊口瘡疫苗多為弱毒苗，而羊口瘡弱毒苗在生產和應用過程中會面臨病毒擴散、毒力返強的風險。為此，安全性能高、免疫原性強、不存在宿主致病風險的羊口瘡基因工程亞單位疫苗的研制就顯得極為迫切。已有研究表明，F1L具有肝素結合活性，使該蛋白在細胞的吸附和侵入過程中可能起重要的作用[21]。與之相一致，Gallina等[12]研究發(fā)現，F1L重組蛋白能夠刺激機體產生功效高效的中和抗體，可能通過阻止ORFV對宿主細胞的吸附而發(fā)揮免疫保護作用。而作為ORFV囊膜的重要組分，B2L蛋白夠誘導機體產生高水平的IgG，王延璞等[26]將B2L基因與pGEM-4Z載體重組，獲得了具有較高表達水平且能夠傳代的重組菌，這為ORFV亞單位疫苗的研制奠定了良好的基礎。鑒于F1L和B2L蛋白的重要性，趙魁[7]構建了F1L和B2L基因單獨表達以及串聯(lián)表達的核酸疫苗，免疫效果優(yōu)于單獨F1L或B2L基因核酸疫苗，這說明F1L和B2L基因串聯(lián)表達的重組蛋白的免疫效果應該更好。本試驗將去掉信號肽區(qū)域的F1L和B2L基因串聯(lián)，并在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)成功獲得了部分分泌型的F1L和B2L串聯(lián)重組蛋白，為以后ORFV基因工程亞單位疫苗的批量生產提供了一定的理論依據。