重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7對(duì)原發(fā)性開角型青光眼小梁網(wǎng)細(xì)胞增殖的影響

周 芳, 吳瑜瑜

原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)是青光眼的主要類型之一，以眼壓升高時(shí)房角卻始終開放為特點(diǎn)，至今發(fā)病機(jī)制未完全闡明。小梁網(wǎng)細(xì)胞為研究POAG發(fā)病機(jī)制的主要靶細(xì)胞，相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)小梁網(wǎng)細(xì)胞的作用亦為研究的熱點(diǎn)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein，BMP7)是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的一員，最初作為骨誘導(dǎo)因子被發(fā)現(xiàn)，具有誘導(dǎo)新骨形成、骨重塑及造血等功能[1]；此家族為TGF-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族中最大的亞群。BMP7由431個(gè)氨基酸殘基通過二硫鍵連接，構(gòu)成同源二聚體，其中心區(qū)域胱氨酸手形結(jié)構(gòu)的折疊與二聚體的構(gòu)型均呈高度保守性，且二聚體的單體結(jié)構(gòu)以對(duì)稱軸為中心可旋轉(zhuǎn)180°，為BMP7生物學(xué)功能的發(fā)揮提供重要的構(gòu)型基礎(chǔ)。BMP7的生物活性受到BMPs相關(guān)蛋白(如：Noggin，follistatin，chordin等)的抑制[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，POAG患者房水中TGF-β2的表達(dá)水平顯著升高，TGF-β2在房水中的高表達(dá)可能與POAG的發(fā)生密切相關(guān)[3]。研究表明，TGF-β2可誘導(dǎo)纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor，PAI-1)在人小梁網(wǎng)細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)沉積，致使眼壓升高，且升高程度與FN和PAI-1在人小梁網(wǎng)細(xì)胞的表達(dá)量呈正相關(guān)[4]。Fuchshofer等研究表明，BMP7可抑制由TGF-β2誘導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)，血小板生成蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)，Ⅳ、Ⅵ型膠原蛋白，F(xiàn)N和PAI-1在人小梁網(wǎng)細(xì)胞ECM的表達(dá)；且BMP7可增加基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP2)在小梁網(wǎng)細(xì)胞ECM的表達(dá)水平以促使細(xì)胞因子的降解，并提出POAG的發(fā)生可能是因TGF-β2在小梁網(wǎng)組織表達(dá)水平的增加導(dǎo)致BMP7表達(dá)量相對(duì)性降低，致使兩者的動(dòng)態(tài)平衡被打破[5]。Wordinger等檢測(cè)到BMP7表達(dá)于人小梁網(wǎng)細(xì)胞、視乳頭軸突和篩泡細(xì)胞，且表明BMP7通過表達(dá)水平的改變影響人小梁網(wǎng)細(xì)胞和視乳頭功能的發(fā)揮[6]。本研究擬探討B(tài)MP7在POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞的生物學(xué)作用。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2011年4月—2012年12月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受小梁切除術(shù)且術(shù)中未使用絲裂霉素的23名POAG患者為研究對(duì)象，男性8例，女性15例，年齡(42.1±10.7)歲(20～60)歲?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)眼壓、超聲生物顯微鏡、房角鏡、視野等檢查確診為POAG；(2)術(shù)前未接受相關(guān)手術(shù)治療或虹膜激光治療；(3)眼部無(wú)其他伴發(fā)疾病?；颊咝行×呵谐g(shù)過程中，收集23例含小梁網(wǎng)組織大小約2 mm×2 mm的深層鞏膜組織塊。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者術(shù)前均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，將從小梁切除術(shù)中取得帶小梁網(wǎng)的鞏膜內(nèi)板層組織塊接種于一次性無(wú)菌塑料培養(yǎng)瓶壁，確認(rèn)組織塊內(nèi)皮面并將小梁網(wǎng)面貼壁，置入無(wú)菌培養(yǎng)箱，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后進(jìn)行消化傳代。取第3代POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞制備細(xì)胞鋪片，并行人眼小梁網(wǎng)細(xì)胞神經(jīng)原特異性烯醇化酶、FN及層黏連蛋白免疫組織化學(xué)染色鑒定。

1.2.2方法 取傳3代POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105mL-1，平均接種于96孔板，待細(xì)胞60%融合，無(wú)血清培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。分別加入rhBMP7終濃度為0(對(duì)照組)，20，50，80，100，200 ng/mL的無(wú)血清培養(yǎng)基干預(yù)24 h，采用CCK8法檢測(cè)不同rhBMP7終濃度下細(xì)胞增殖率的變化；經(jīng)CFDA SE標(biāo)記的傳3代小梁網(wǎng)細(xì)胞，平均接種于預(yù)置無(wú)菌蓋玻片的6孔板、25 mL一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待細(xì)胞60%融合，無(wú)血清培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。

1.2.3檢測(cè)不同終濃度rhBMP7對(duì)POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞增殖的影響 取傳3代POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10-5mL左右，平均接種于96孔板，待細(xì)胞60%融合，無(wú)血清培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。分別加入rhBMP7終濃度為0(對(duì)照組)，20，50，80，100，200 ng/mL的無(wú)血清培養(yǎng)基干預(yù)24 h，加入CCK8避光孵育1.5 h，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各處理組吸光度(即OD值)。

1.2.3.1熒光顯微鏡觀察各處理組細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度

1.2.3.1.1CFDA SE標(biāo)記細(xì)胞 取傳3代POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞，同步化、消化、離心同上。用1 mL上述配置的CFDA SE細(xì)胞標(biāo)記液懸浮離心后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105mL-1；稀釋CFDA SE儲(chǔ)存液，輕輕混勻；避光孵育20 min；加入10 mL含20%胎牛血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫下顛倒混勻；離心、充分洗滌細(xì)胞，棄上清；按照細(xì)胞濃度為1×105mL-1，平均接種于預(yù)置無(wú)菌蓋玻片的6孔板、25 mL一次性無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后，在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記效果及細(xì)胞接種密度，經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)綠色熒光。

1.2.3.1.2熒光顯微鏡下觀察各處理組對(duì)POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞增殖的影響及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞增殖的變化 分別吸棄上述接種于預(yù)置無(wú)菌蓋玻片的6孔板以及25 mL一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液，漂洗2次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化；加入不同濃度rhBMP7[0(對(duì)照組)，20，50，80，100，200 ng/mL]的無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h；熒光顯微鏡下觀察6孔板經(jīng)標(biāo)記的對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞的數(shù)量及熒光強(qiáng)度的變化，并拍照；將培養(yǎng)于25 mL一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行離心，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析各處理組單細(xì)胞的分裂、增殖情況；做直方圖及疊加圖。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 組織塊經(jīng)確切貼壁7 d后，于倒置顯微鏡下觀察，可見小梁網(wǎng)細(xì)胞自組織塊周邊爬出。爬出細(xì)胞以組織塊為中心，呈內(nèi)密外疏樣散在分布，形態(tài)不一，呈紡錘形、梭形、不規(guī)則形等，并有多個(gè)突起。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞分裂、增殖，形成以組織塊為中心的放射狀單層細(xì)胞融合。傳3～5代的POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞形態(tài)較均一，呈單層穩(wěn)定生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力強(qiáng)，融合期細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)明顯的接觸抑制現(xiàn)象，此時(shí)的小梁網(wǎng)細(xì)胞適于實(shí)驗(yàn)研究。免疫細(xì)胞化學(xué)S-P法結(jié)果顯示：小梁網(wǎng)細(xì)胞FN染色陽(yáng)性，胞質(zhì)呈棕色，彼此相連呈單層網(wǎng)狀；層黏連蛋白染色陽(yáng)性示：胞質(zhì)呈紅色，顆粒狀，散在分布；波形蛋白(vimentin,VN)染色陽(yáng)性，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)廣泛分布棕黃色顆粒；神經(jīng)原特異性烯醇化酶染色陽(yáng)性，表現(xiàn)為彌漫性紅色顆粒遍及整個(gè)細(xì)胞。第Ⅷ因子相關(guān)抗原染色示：細(xì)胞胞質(zhì)不著色，僅細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色(圖1)。

2.2CCK8法檢測(cè)rhBMP7對(duì)POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)終濃度為0(對(duì)照組)，20，50，80，100，200 ng/mL rhBMP7蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基處理POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞24 h后，經(jīng)全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)，各處理組的OD值分別為：(0.561 2±0.026 9)，(0.724 2±0.039 3)，(1.416 0±0.016 2)，(1.740 4±0.039 2)，(1.853 8±0.014 5)，(1.936 4±0.054 6)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率分別為：1.37%，2.96%，3.70%，3.96%，4.15%，levene方差齊性檢驗(yàn)F=2.249，P>0.05，說明各處理組OD值符合正態(tài)分布；單因素方差分析示：各處理組OD值與對(duì)照組OD值比較，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各處理組LSD組間比較，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

POAG：原發(fā)性開角型青光眼. A：組織塊周邊細(xì)胞爬出； B：組織塊周邊呈單層細(xì)胞生長(zhǎng)； C：POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞 H-E染色； D：POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞FN染色； E：POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞 LN染色； F：POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞VN染色； G：POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞NSE染色； H：POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞FN染色.圖1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果( ×100)Fig 1 Cell culture and identification results( ×100)

2.3熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況 CFDA SE標(biāo)記的POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞，經(jīng)終濃度為0 (對(duì)照組)，20，50，80，100，200 ng/mL rhBMP7蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基處理48 h后，熒光顯微鏡下可見在一定范圍內(nèi)，隨著rhBMP7濃度的增加，標(biāo)記的細(xì)胞量增加，與光學(xué)顯微鏡下觀察情況相對(duì)應(yīng)(圖2)。

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 CFDA SE標(biāo)記的POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞，經(jīng)終濃度為20，50，80，100，200 ng/mL rhBMP7蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基處理48 h后，將各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(0 ng/mL)疊加后所得直方圖可見：分裂細(xì)胞所占的比例分別為17.85%，18.63%，20.10%，27.45%及72.41%；隨著rhBMP7終濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?，曲線及峰左移(圖3)。

3 討 論

POAG為不可逆性的高致盲眼病之一，以眼內(nèi)壓升高、房角開放為特點(diǎn)，至今病因尚未完全明了。正常眼壓的維持依賴于房水生成與排出速率。房水由睫狀體生成，主要經(jīng)小梁網(wǎng)通路排出。Zhao等研究表明：內(nèi)源性BMP4及BMP7在小鼠胚胎后期和產(chǎn)后階段的睫狀體中呈高水平表達(dá)，且可修復(fù)由其特異性抑制因子Noggin引起的睫狀上皮的缺陷[7]。Wordinger等檢測(cè)到BMP7表達(dá)于人小梁網(wǎng)細(xì)胞、視乳頭軸突和篩泡細(xì)胞，且BMP7表達(dá)水平的改變可能會(huì)干預(yù)小梁網(wǎng)和視乳頭組織功能的發(fā)揮[6]。睫狀體和小梁網(wǎng)組織主導(dǎo)房水的生成和外流，BMP7可能通過改變其在這些組織的表達(dá)水平參與POAG的發(fā)生及進(jìn)展。因此，本研究將BMP7納入研究，以探討其在POAG發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

小梁網(wǎng)組織起源于神經(jīng)外胚層神經(jīng)嵴的間充質(zhì)細(xì)胞，VN為間充質(zhì)起源組織的固有成分，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)為神經(jīng)嵴組織來(lái)源的一種酶，表達(dá)VN及NSE是其生物特性之一；Schlemm管來(lái)源于中胚層， 其可合成第Ⅷ因子相關(guān)抗原(ⅧR:Ag)，利用ⅧR:Ag免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可鑒別中胚層來(lái)源的Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞[8]。經(jīng)免疫組織化學(xué)S-P法提示，體外培養(yǎng)細(xì)胞為POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞。

研究表明：TGF-β2在POAG患者房水、小梁網(wǎng)等組織及細(xì)胞中表達(dá)水平顯著增加，且可誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子(如：FN，CTGF，PAI-1等)沉積于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，增加房水外流的阻力和降低小梁網(wǎng)功能、引起視乳頭組織重構(gòu)等改變，參與POAG的發(fā)生、進(jìn)展[3-4]。Yu等報(bào)道：TGF-β2通過激活衰老相關(guān)p16-pRb信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人小梁網(wǎng)細(xì)胞發(fā)生衰老樣改變，降低小梁網(wǎng)細(xì)胞的功能[9]。趙太宏等對(duì)比POAG患者和正常尸眼小梁網(wǎng)細(xì)胞凋亡比例表明：POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞凋亡率明顯高于正常人小梁網(wǎng)細(xì)胞，且指出：人小梁網(wǎng)細(xì)胞數(shù)量減少，致其濾過功能降低，此現(xiàn)象可能在POAG發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10]。Fuchshofer等研究表明：BMP7可完全抑制由TGF-β2誘導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、血小板生成蛋白-1、Ⅳ、Ⅵ型膠原蛋白、FN和PAI-1在人小梁網(wǎng)細(xì)胞ECM的表達(dá)，并提出POAG的發(fā)生可能是因TGF-β2在小梁網(wǎng)組織表達(dá)水平增加致BMP7表達(dá)量相對(duì)性降低，致使兩者的動(dòng)態(tài)平衡被打破。Fuchshofer等進(jìn)一步研究指出，BMP7是通過Smad7信號(hào)發(fā)揮此作用[11]。

POAG：原發(fā)性開角型青光眼; rhBMP7:重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白7. 1：熒光顯微鏡觀察；2:倒置顯微鏡觀察. A～F分別為0(對(duì)照組)，20，50，80，100，200 ng/mL rhBMP7處理POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞.圖2 POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞增殖數(shù)量Fig 2 The proliferation count of POAG trabecular meshwork cells

POAG：原發(fā)性開角型青光眼; rhBMP7:重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白7. A～E：經(jīng)20，50,80,100,200 ng/mL rhBMP7處理POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞.圖3 POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞增殖率Fig 3 The proliferation rate of POAG trabecular meshwork cells

本研究表明：rhBMP7蛋白在20～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞具有促增殖作用且呈一定的劑量-時(shí)間依賴性。提高BMP7于小梁網(wǎng)細(xì)胞的濃度可促進(jìn)小梁網(wǎng)細(xì)胞的增殖，增加小梁網(wǎng)細(xì)胞數(shù)量，提高房水排出速率，降低眼內(nèi)壓；若能促進(jìn)POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞選擇性分泌BMP7，實(shí)現(xiàn)POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞的再生和功能的修復(fù)，且可抑制因TGF-β2增多所致眼壓升高的細(xì)胞因子，就可能為POAG的治療提供新的思路。但是，增殖的POAG小梁網(wǎng)細(xì)胞的功能，如：反映收縮功能的肌絲蛋白、反應(yīng)吞噬功能的線粒體的活性狀態(tài)等，還有待進(jìn)一步研究。