miR-138在鼻咽癌患者中的預(yù)后價(jià)值及其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

王英力， 趙 群， 蘭 娜， 王書謙

鼻咽癌是一種發(fā)源于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤[1-4]。與其他的頭頸部惡性腫瘤相比，鼻咽癌在發(fā)生、病因、臨床表現(xiàn)以及腫瘤治療方面存在顯著的差別。中國(guó)是鼻咽癌高發(fā)國(guó)家，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)，因此該病成為我國(guó)面臨的一個(gè)重大健康問題[5]。目前多種抗腫瘤方法已經(jīng)應(yīng)用到癌癥治療中，但是鼻咽癌的預(yù)后情況仍然不理想[6]。如何進(jìn)一步改善此疾病的預(yù)后，是目前鼻咽癌治療過程中亟待解決的問題。

microRNAs(miRNAs)是近年來癌癥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。miRNAs是一系列非編碼的小RNA分子，其長(zhǎng)度約為18～22個(gè)核苷酸。研究表明，它們可以通過結(jié)合靶mRNA的3′非翻譯區(qū)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控目的基因的表達(dá)[7]。此外，miRNAs參與了包括癌癥細(xì)胞在內(nèi)的多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲及凋亡過程[8]，說明了其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中潛在的生物學(xué)功能。在鼻咽癌細(xì)胞中，miR-138作為miRNAs家族一員，被證明具有顯著的抑癌作用，但是其臨床意義和系統(tǒng)的生物學(xué)功能尚未闡明[9]。

本研究旨在分析鼻咽癌組織中miR-138的表達(dá)量，探究其在癌癥患者中的預(yù)后價(jià)值，通過檢測(cè)miR-138對(duì)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，進(jìn)一步明確其在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2006年5月—2011年6月在筆者醫(yī)院接受腫瘤切除術(shù)的118名鼻咽癌患者為研究對(duì)象，男性75例，女性43例，年齡(55.6±12.8)歲(30～78歲)。患者納入標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)經(jīng)組織病理學(xué)確診為鼻咽癌；(2)病史資料詳細(xì)完整；(3)術(shù)前未接受過任何抗腫瘤治療；(4)無其他系統(tǒng)腫瘤疾病病史；(5)無其他伴發(fā)疾病。收集118例鼻咽癌組織，同時(shí)取對(duì)應(yīng)的臨近正常鼻咽部組織為對(duì)照樣本，所有組織凍存在液氮中備用。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者術(shù)前均簽署了知情同意書。對(duì)術(shù)后患者進(jìn)行為期5年的隨訪，并對(duì)患者的生存情況進(jìn)行記錄。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 鼻咽癌細(xì)胞系CNE1和正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69均購(gòu)自中國(guó)上海細(xì)胞研究所。所有細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清)，并置于體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)CNE1細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰蛋白酶處理消化后，接種于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染載體包括：miR-138-mimic(miR-138模擬物)，miR-138-inhibitor(miR-138抑制物)，NC-mimic(miR-138模擬物陰性對(duì)照)和NC-inhibitor(miR-138抑制物陰性對(duì)照)，所有產(chǎn)品均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司。其中轉(zhuǎn)染miR-138模擬物或抑制物的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的細(xì)胞為對(duì)照組，另外設(shè)置未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照組。所有轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使用Lipofectamine 2000TM試劑實(shí)現(xiàn)。將miRNA載體與轉(zhuǎn)染試劑混合均勻后加入細(xì)胞稀釋液中，混勻后置于培養(yǎng)6 h，更換新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 使用Trizol試劑提取樣品中的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)合成miR-138對(duì)應(yīng)的單鏈cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex TaqTM 試劑盒(美國(guó)Biosystems公司)配置qRT-PCR反應(yīng)體系，并在Applied Biosystems 7500 Sequence檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。qRT-PCR的條件為：95 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 20 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。所有樣品中miR-138的相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt法計(jì)算。以U6作為內(nèi)參基因。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，接種于96孔板(細(xì)胞密度為1×105mL-1)，分別于0，24，48和72 h時(shí)添加50 μL MTT試劑，孵育4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入500 μL的20% SDS并于室溫下孵育過夜。使用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)液在490 nm處的吸光度值，用以評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞將接種在不含血清的DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1，吸取150 μL細(xì)胞稀釋液至Transwell上室中，下室為含有20 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液作為細(xì)胞趨化劑，將小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取出后使用倒置顯微鏡觀察小室中細(xì)胞的數(shù)目，隨機(jī)選取7個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，用以評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移能力。使用鋪有Matrigel膠的Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。2組間的差別采用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行分析。miR-138和患者的臨床病理特征之間的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)分析。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)分析患者的生存率。采用Cox回歸分析確認(rèn)miR-138在鼻咽癌中的預(yù)后價(jià)值。P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miR-138在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平 經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)，miR-138在鼻咽癌組織中的表達(dá)量較癌旁正常組織顯著減低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。miR-138在鼻咽癌細(xì)胞CNE1中的表達(dá)量顯著低于在正常細(xì)胞NP69中的表達(dá)量，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖1)。

A：miR-138在鼻咽癌組織和癌旁組織的比較; B:miR-138在鼻咽癌CNE1和正常細(xì)胞中的比較.圖1 miR-138在鼻咽癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)量水平Fig 1 Expression of miR-138 in nasopharyngeal carcinoma tissues and cells

2.2miR-138表達(dá)量與患者臨床病理特征之間的關(guān)系 將患者以miR-138表達(dá)量均值為截?cái)嘀?，分為miR-138低表達(dá)組(n=64)和miR-138高表達(dá)組(n=54)。結(jié)果表明，miR-138的表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.007)和TNM分期(P=0.003)相關(guān)，而與患者的年齡、性別、組織學(xué)分型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及分化程度無顯著的相關(guān)性(P>0.05，表1)。

2.3miR-138在鼻咽癌患者中的預(yù)后價(jià)值 通過5年的隨訪研究，記錄并分析鼻咽癌患者的生存情況，進(jìn)而明確miR-138表達(dá)量與癌癥患者總生存率的關(guān)系。Kaplan-Meier生存曲線顯示，患者的總生存率在miR-138低表達(dá)量的患者中較miR-138高表達(dá)的患者差，且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankP=0.002，圖2)。

通過Cox單因素回歸分析證明，miR-138(HR=2.947，95%CI=1.423～6.103，P=0.004)和TNM分期(HR=2.502，95%CI=1.209～5.178，P=0.013)均與患者的總生存率顯著相關(guān)；多因素分析結(jié)果表明，miR-138(HR=2.308，95%CI=1.059～5.031，P=0.035)和TNM分期(HR=2.306，95%CI=1.044～5.093，P=0.039)是鼻咽癌的兩個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子(表2)。

2.4miR-138對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，獲得miR-138表達(dá)量顯著增加的過表達(dá)miR-138鼻咽癌細(xì)胞(P<0.01)，表達(dá)量顯著降低的抑制miR-138表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞(P<0.01)。MTT結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-138可以顯著降低鼻咽癌細(xì)胞CNE1的增殖能力(P<0.05)，而抑制miR-138表達(dá)可以顯著促進(jìn)癌細(xì)胞CNE1的增殖能力(P<0.05)；Transwell結(jié)果表明，癌細(xì)胞CNE1的遷移和侵襲能力在過表達(dá)miR-138細(xì)胞中顯著降低(P<0.001)，而在抑制miR-138表達(dá)的細(xì)胞中顯著增加(P<0.01，圖3)。

表1miR-138表達(dá)量與鼻咽癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

Tab1Association of miR-138 expression with clinicopathological features of the patients

臨床病理特征nmiR-138 表達(dá)量低表達(dá)高表達(dá)χ2P年齡/歲 ≤ 50 371918 > 50814536性別 女432221 男754233組織學(xué)分型 鱗狀癌733934 其他(腺癌、黏液表皮樣癌)452520淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無542232 有644222遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 無623032 有563422分化程度 高度/中等分化703832 低分化482622TNM分期 Ⅰ～Ⅱ572334 Ⅲ～Ⅳ6141200.1810.6710.2580.6120.0510.8217.3070.0071.8010.1800.0000.9908.5660.003

圖2 不同miR-138表達(dá)量的鼻咽癌患者的Kaplan-Meier生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival curves for patients with different miR-138 expression

表2 鼻咽癌患者中miR-138表達(dá)量的Cox回歸分析

3 討 論

近年來，miRNAs的生物學(xué)作用備受關(guān)注，研究報(bào)道稱其可以通過調(diào)控相應(yīng)的靶基因從而參與細(xì)胞中各種各樣的生命活動(dòng)[10]。在腫瘤細(xì)胞中，大部分受miRANs調(diào)控的基因在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色，因此miRNAs在腫瘤治療方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[11]。此外，這些在腫瘤樣品中表達(dá)量發(fā)生變化的miRNAs，還被證明具有顯著的診斷或者預(yù)后價(jià)值[12]。例如，Li等發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者血清中的miR-486表達(dá)量上調(diào)，可以作為一個(gè)有效的診斷標(biāo)記物應(yīng)用到癌癥治療中[13]。在膀胱癌組織中檢測(cè)到的高表達(dá)miR-222與患者的總生存率顯著相關(guān)，證明了其在膀胱癌中的預(yù)后價(jià)值[14]。

A：轉(zhuǎn)染miR-138模擬物的細(xì)胞中miR-138表達(dá)量顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-138抑制物的細(xì)胞中miR-138表達(dá)量顯著下調(diào)；B～D：過表達(dá)miR-138可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制miR-138表達(dá)可明顯促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力. 1：未轉(zhuǎn)染；2：miR-138模擬物；3：miR-138模擬物陰性對(duì)照；4：miR-138抑制物；5：miR-138抑制物陰性對(duì)照. 與未轉(zhuǎn)染組比較：△:P<0.05，△△:P<0.01，△△△：P<0.001.圖3 miR-138表達(dá)量對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響Fig 3 Effects of miR-138 expression on cancer cell proliferation, migration and invasion

在鼻咽癌患者中，同樣發(fā)現(xiàn)了一些具有較高臨床意義的miRNAs成員，包括miR-744和miR-451[15-16]。但是目前對(duì)miRNAs功能的認(rèn)識(shí)有限，尤其是在鼻咽癌發(fā)展過程中具有生物學(xué)功能的miRNAs分子。因此，本研究對(duì)miR-138在鼻咽癌中的表達(dá)情況以及生物學(xué)功能進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查分析，旨在進(jìn)一步理解miRNAs與癌癥的關(guān)系，并為鼻咽癌的治療提供新的研究思路。

本研究使用qRT-PCR檢測(cè)了118對(duì)鼻咽癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中miR-138的表達(dá)量水平，發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織，說明miR-138可能是潛在的鼻咽癌抑癌基因。為驗(yàn)證此結(jié)果，進(jìn)一步對(duì)miR-138在鼻咽癌細(xì)胞CNE1中的表達(dá)量進(jìn)行了探究，同樣檢測(cè)到了較正常鼻咽上皮細(xì)胞表達(dá)量顯著降低的miR-138，提示其可能與腫瘤的發(fā)生存在相關(guān)性。這一結(jié)果與已有研究結(jié)果一致[9]，說明miR-138在鼻咽癌中潛在的抑癌作用。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明，低表達(dá)miR-138與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期具有顯著的相關(guān)性，一定程度上說明miR-138可能參與到了鼻咽癌的腫瘤發(fā)展過程中。通過對(duì)118例鼻咽癌患者進(jìn)行為期5年的隨訪，分析其生存率數(shù)據(jù)，證明miR-138低表達(dá)患者較高表達(dá)患者具有較差的總生存率，且低表達(dá)miR-138在鼻咽癌患者中是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子，提示低表達(dá)miR-138可能與鼻咽癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-138在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究使用miR-138模擬物和抑制物，分別構(gòu)建了體外過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-138的鼻咽癌細(xì)胞體系。通過MTT法和Tranwell實(shí)驗(yàn)法，證明了過表達(dá)miR-138可顯著抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE1的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的能力，而抑制miR-138的表達(dá)則對(duì)這些生物學(xué)活動(dòng)有明顯的促進(jìn)作用。以上結(jié)果證明，miR-138具有抑制鼻咽癌發(fā)展的重要作用。除鼻咽癌外，miR-138在其他腫瘤細(xì)胞中也被證明與癌癥的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性，例如在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，miR-138同樣被檢測(cè)到具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用，在癌癥的發(fā)展過程中扮演了抑癌基因的角色[17]。miR-138作為抑癌基因在結(jié)直腸癌中可以顯著降低癌細(xì)胞的增殖能力，并影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期[18]。雖然本研究證明了miR-138在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，但是其發(fā)揮抑癌作用的相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚，這將成為未來的研究重心之一。