A20在浸潤性乳腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

曾偉超， 許建華， 黃種心

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，約占女性癌癥患者總數(shù)的25%和癌癥總死亡數(shù)的15%。截至2012年，我國約有乳腺癌患者170萬，其中死亡人數(shù)約52萬[1]。乳腺癌的早期診斷困難，因此，尋找早期診斷的生物指標(biāo)有很大的臨床意義。A20被稱為腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNF-alpha-induced protein 3，TNFAIP3)，是在誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的反應(yīng)中檢測到的一個誘導(dǎo)性表達蛋白[2]。A20家族為卵巢腫瘤(ovian tumor，OTU)結(jié)構(gòu)域超家族的一個亞組。A20鋅指蛋白包含一個可以水解聚泛素鏈的功能性O(shè)TU結(jié)構(gòu)域[3]。研究表明，A20在非霍奇金淋巴瘤的部分亞型中發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用[4]，但也有文獻報道，A20可通過提高惡性膠質(zhì)瘤干細胞的存活率來發(fā)揮腫瘤增強因子的作用[5]，可見在不同的惡性腫瘤中，A20可能發(fā)揮不同的作用。

本研究基于組織芯片技術(shù)，運用免疫組織化學(xué)方法檢測145例乳腺癌組織及與之部分配對的46例癌旁組織中A20蛋白的表達，并分析A20的表達與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，初步探討A20在乳腺癌中發(fā)揮的作用。

1 對象與方法

1.1對象 收集2004年8月-2008年12月手術(shù)的女性乳腺癌患者145例，年齡(59.57±12.53)歲(33～88歲)；浸潤性導(dǎo)管癌119例，浸潤性小葉癌4例，黏液癌2例，導(dǎo)管內(nèi)癌1例，浸潤性導(dǎo)管癌合并浸潤性微乳頭狀癌9例，浸潤性導(dǎo)管癌合并浸潤性小葉癌3例，浸潤性導(dǎo)管癌合并髓樣癌2例，浸潤性導(dǎo)管癌合并黏液癌5例。納入和排除標(biāo)準均遵循乳腺癌臨床病理分期(AJCC第六版)[6]。患者術(shù)前均未行放療、化療及激素治療。

145例乳腺癌組織芯片及與之部分配對(46例)的癌旁組織芯片均購自上海芯超生物科技有限公司。同一患者的癌組織和癌旁組織形成完全配對。所有標(biāo)本的使用均征得上海芯超生物科技有限公司倫理委員會同意，患者本人知情并簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器 TNFAIP3抗體(ab92324，英國Abcam公司)；聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(SV0002)及蘇木精染色劑(AR1180-1)(中國博士德生物工程有限公司)；5% BSA封閉液(SW3015，美國Solarbio公司)；DAB顯色試劑盒(CW0125)及中性樹脂(CW0136)(中國康為世紀生物科技有限公司)；恒溫搖床(TC-100B，中國上海天呈科技公司)；生物顯微鏡(上海領(lǐng)成生物科技有限公司)；組織芯片掃描儀(美國Aperio公司)。相關(guān)的雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)及人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)基因表達狀態(tài)等數(shù)據(jù)由上海芯超生物科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)Envision兩步法檢測A20蛋白的表達 組織芯片放入75 ℃烤箱中烤1.5 h；脫蠟：切片在二甲苯Ⅰ脫蠟10 min后，再用二甲苯Ⅱ脫蠟10 min；將切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇及純化水中，各5 min。高壓熱修復(fù)后自然冷卻，用PBS沖洗3次，每次3 min。用0.5% Triton X-100室溫通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；孵育一抗：水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗TNFAIP3(1∶100)，放入濕盒，4 ℃孵育過夜。切片復(fù)溫45 min后PBS洗滌，滴加兔/鼠二抗工作液，室溫孵育1 h，PBS充分淋洗；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS或自來水沖洗1 min；蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸酒精分化，返藍；自來水沖洗1 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3.2組織芯片的掃描讀片及染色結(jié)果判定 讀片結(jié)果采用雙盲法判定，并由2位副高以上職稱的病理醫(yī)師分別讀片后進行判定，判定標(biāo)準采用半定量積分法[7]。在高倍顯微鏡下觀察(×200)，隨機選擇3個有代表性的高倍鏡視野進行判定并計分。具體方法如下：(1)染色強度判定，在低倍鏡下進行觀察，分為弱、中及強陽性，其中弱陽性為淺黃色(+或1)、中陽性為棕黃色(或2)、強陽性為棕褐色(或3)(如組織中既有中陽性又有強陽性時，記為2～3，余類似)。細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的棕色染色顆粒被視為陽性，同時依據(jù)染色的強度設(shè)定得分值，即染色強度評分1分(<1)，2分(1<強度≤2)，3分(2<強度≤3)。(2)染色陽性率判定，首先在低倍鏡下觀察組織點的整個視野，然后選取3個染色強度不同的視野，并在高倍鏡下進行判讀，如果定位于胞核或者胞質(zhì)、胞膜，則在每個視野中隨機記100個細胞，計算其中的陽性細胞所占的百分率，取3個不同視野的均數(shù)作為該組織點最終的染色陽性率。視野中的著色陽性細胞數(shù)<70%為1分，70%～79%為2分，80%～90%為3分時，91%～100%為4分。(3)總評分及分組情況，以“染色強度評分”和“染色陽性率評分”的乘積為總評分，并進行分組，<8分為抗體低表達組，≥8分為抗體高表達組。

1.3.3隨訪 通過電話和門診復(fù)查的方式進行隨訪，隨訪的起始時間為患者的手術(shù)時間，截止時間為2014年7月，隨訪時間為5.6～10年。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。A20蛋白在乳腺癌組織及其配對的癌旁組織中的表達差異分析采用卡方檢驗。生存曲線采用Kaplan-Meier法和Log-rank統(tǒng)計檢驗進行分析；單因素及多因素生存分析方法采用Cox比例風(fēng)險回歸模型。A20的表達與各臨床病理因素及指標(biāo)之間的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗。所有的檢驗均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1A20在乳腺癌組織和配對的癌旁組織中表達及其與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 因?qū)嶒灲Y(jié)果不理想，剔除11組完全配對的組織樣本，余35組完全配對的乳腺癌組織與癌旁組織納入統(tǒng)計學(xué)分析。A20蛋白主要表達于胞質(zhì)中，部分細胞的胞核亦可著色。35例乳腺癌組織中，高表達25例(71.4%)，低表達10例(28.6%)(圖1A，1B)；在配對的35例癌旁組織標(biāo)本中，高表達12例(34.3%)，低表達23例(65.7%)(圖1C，1D)?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示，A20蛋白的表達在乳腺癌組織和配對的癌旁組織中存在差異(P<0.05)。運用Spearman秩相關(guān)方法對A20的表達與145例乳腺癌患者的臨床病理參數(shù)之間進行相關(guān)性分析，結(jié)果示二者間不存在直線相關(guān)關(guān)系(P>0.05,表1)。

2.2A20表達與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)性分析 145例中，A20高表達71例，其中死亡29例，生存42例，生存率為59.2%；A20低表達74例，其中死亡14例，生存60例，生存率為81.1%。高表達組的平均生存時間為84.055月，95%CI為(75.200～92.910)；低表達組的平均生存時間為102.170月，95%CI為(93.905～110.435)(表2)。2組的生存曲線見圖2，可見高表達A20組患者的總體生存率明顯低于低表達組(χ2=8.492，P=0.004)。

A20蛋白主要表達于胞質(zhì)中，其中A,C圖為高表達，B,D圖為低表達； A,B：癌組織； C,D：癌旁組織.圖1 A20在乳腺癌和癌旁組織中的表達( ×400)Fig 1 Expression of A20 protein in breast cancer tissue and para-carcinoma tissue( ×400)

表1A20在145例乳腺癌組織中的表達及與臨床病理特征之間的關(guān)系

Tab1Correlation between the clinicopathological characteristics and A20 expression in breast cancer tissue

臨床參數(shù)nA20表達高低秩相關(guān)系數(shù)P值年齡/歲 <60844440-0.0510.544 ≥60612734病理分級 1440 2703535-0.1020.244 3713239d腫瘤/cm <2351223 2～58845430.1640.053 >51587 侵犯胸壁或皮膚220淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無743440 有6935340.0480.571TNM分期 0110Ⅰ228140.0910.283Ⅱ783741Ⅲ392118

表2乳腺癌中A20高表達組和低表達組生存時間的平均值和95%可信區(qū)間

Tab2Mean value and 95% confidence interval of overall survival time between A20 high expression group and A20 low expression group in breast cancer

A20表達估算標(biāo)準誤差95%CI下限95%CI上限低表達102.1704.21793.905110.435高表達84.0554.51875.20092.910總體94.7093.22488.391101.027

2.3Cox比例風(fēng)險回歸模型的單因素和多因素分析 將患者的年齡、TNM分期、病理分級、腫瘤大小及部位、淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)侵犯及A20的表達水平等可能影響乳腺癌預(yù)后的因素進行單因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T分期(P=0.011)、N分期(P=0.005)、TNM綜合分期(P=0.004)及A20的表達水平(P=0.005)與乳腺癌患者的總生存率之間存在相關(guān)。對這些臨床參數(shù)進行Cox比例風(fēng)險回歸模型多因素分析結(jié)果顯示，A20的表達水平(P=0.038)仍是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨立因素(表3)。

圖2 乳腺癌中高表達A20組和低表達A20組的生存曲線Fig 2 Survival curves of A20 high expression group and A20 low expression group in breast cancer

2.4A20的表達與其他相關(guān)臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析 運用Spearman秩相關(guān)分析A20表達與AR,Ki-67,P53,PR,ER,EGFR和HER-2基因的表達狀態(tài)之間的相關(guān)性，顯示P>0.05，可見二者之間不存在直線相關(guān)關(guān)系。

3 討 論

A20蛋白是1990年第1次被發(fā)現(xiàn)的，它最為人們所熟知的作用是通過抑制NF-κB信號通路來抑制炎癥。早有研究發(fā)現(xiàn)，A20可以結(jié)合到一種名為結(jié)合A20的NF-κB抑制因子(A20-bindind inhibitors of NF-κB activation，ABIN)的蛋白上，而這種蛋白通過過表達來模擬A20抑制NF-κB的作用，表明A20的作用是通過與ABIN這種NF-κB抑制蛋白的相互作用來實現(xiàn)的[8]。

A20在腫瘤中發(fā)揮的作用一直有2種不同意見。有研究發(fā)現(xiàn)，A20可作為一個腫瘤的抑制因子，如在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的研究中發(fā)現(xiàn)，A20基因的失活可以通過構(gòu)成性的NF-κB的激活來促進MM的發(fā)病，這種失活作用并非通過體細胞突變或啟動子的甲基化，而是通過A20基因的缺失來實現(xiàn)[9]。對膿胸相關(guān)淋巴瘤(pyothorax-associated lymphoma，PAL)的研究也發(fā)現(xiàn)，A20基因不正常表達常與PAL相關(guān)，且A20的異?？赡芘cPAL的發(fā)病有關(guān)[10]。相反，在對結(jié)腸癌、結(jié)腸息肉和炎癥性腸病中A20與P53表達的相關(guān)性研究卻發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織、腺瘤樣息肉以及增生性息肉的上皮組織中，A20表現(xiàn)出高表達，且與結(jié)腸息肉的癌變傾向呈正相關(guān)關(guān)系，A20在炎癥性息肉中的表達低于在腺瘤樣息肉以及增生性息肉的上皮組織中的表達，且炎癥性息肉也顯示了較低的癌變傾向；同時研究人員還發(fā)現(xiàn)，A20可以與P53結(jié)合形成復(fù)合體，且在HEK293細胞中發(fā)現(xiàn)A20可在蛋白水平上抑制P53[11]。類似的結(jié)果也見于對膀胱癌及膀胱息肉的相關(guān)研究中[12]。

表3影響乳腺癌預(yù)后因素的Cox單因素和多因素分析

Tab3Univariate and multivariate analysis of factors which affect breast cancer patients' prognosis using Cox proportional hazards model

臨床病理參數(shù)單因素分析HR95%CIP值多因素分析HR95%CIP值A(chǔ)20的表達2.5211.323～4.8040.005☆2.0271.038～3.9580.038☆病理分級0.9270.539～1.5950.784年齡0.9730.531～1.7840.930T分期1.7541.137～2.7080.011☆1.4460.734～2.8520.287N分期1.4741.121～1.9380.005☆1.4410.839～2.4730.185TNM分期2.1121.272～3.5070.004☆0.9900.323～3.0400.986

☆：P<0.05.

組織芯片技術(shù)的發(fā)展，允許科研工作者高效率地完成多樣本的免疫組織化學(xué)檢測，從而能夠初步研究一個基因可能發(fā)揮的作用，并分析其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。在應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究胰腺癌時發(fā)現(xiàn)，A20蛋白在胰腺癌組織中的表達明顯低于正常的胰腺組織，因此，A20在胰腺癌的發(fā)病過程中可能發(fā)揮了潛在的作用[13]。本研究應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究乳腺癌時發(fā)現(xiàn)，A20蛋白在乳腺癌組織及其配對的癌旁組織中的表達存在差異，但Spearman秩相關(guān)方法檢測結(jié)果顯示，A20的表達與患者年齡、病理分級、T分期、N分期和TNM綜合分期之間不存在直線相關(guān)關(guān)系。采用Kaplan-Meier生存分析法和Log-rank統(tǒng)計檢驗進行生存期單因素分析，可知高表達A20組患者的總體生存率明顯低于低表達組，二者間差別有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步運用Cox比例風(fēng)險回歸模型進行單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)，A20的表達可以作為影響乳腺癌患者預(yù)后的一個獨立的危險因素。因此對A20表達情況的檢測有可能成為判斷乳腺癌惡性病變程度和評估預(yù)后的參照因素，同時提示高表達的A20可能參與了乳腺癌的疾病發(fā)展過程并影響患者的預(yù)后。運用Spearman秩相關(guān)檢驗分析A20表達與AR，Ki-67，P53，PR，ER，EGFR和HER-2的表達狀態(tài)之間的相關(guān)性，顯示P>0.05，二者也不存在直線相關(guān)關(guān)系。

本研究認為，A20的高表達是影響乳腺癌患者預(yù)后的不利因素，A20可能參與了乳腺癌患者疾病的進展，因此A20有望成為一個檢測乳腺癌患者疾病發(fā)展及預(yù)后的新型生物學(xué)指標(biāo)。然而，A20在乳腺癌的發(fā)病機制中所起的作用還需進一步進行蛋白及分子水平的功能驗證。