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    參芪扶正注射液調(diào)節(jié)多藥耐藥相關(guān)蛋白7改善紫杉醇和吉西他濱非小細(xì)胞肺癌耐藥

    2018-07-23 03:29:14
    西北藥學(xué)雜志 2018年4期
    關(guān)鍵詞:吉西他濱參芪吉西

    李 磊

    (新汶礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院藥學(xué)部,新泰 271233)

    肺癌臨床高發(fā),我國肺癌發(fā)病率逐年上升,其中非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的75%~80%[1]。非小細(xì)胞肺癌目前的首選治療方法是手術(shù),但對于局部晚期不適合手術(shù)的患者及術(shù)后治療,化療仍是主要手段。

    紫杉醇和吉西他濱是臨床非小細(xì)胞肺癌治療的主要藥物,但臨床多藥耐藥問題嚴(yán)重影響了兩藥在臨床的有效使用[2-3]。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制復(fù)雜,多種因素均可導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的發(fā)生,其中腫瘤細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)蛋白的高表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤藥物耐藥的最主要原因[4]。多藥耐藥相關(guān)蛋白7(MRP7)是多藥耐藥相關(guān)蛋白家族中的一種,其對紫杉烷類和長春花生物堿類藥物具有細(xì)胞外排作用[5-6]。研究表明,在使用過紫杉醇(peclitaxel) 或長春瑞濱并產(chǎn)生耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中MRP7具有高表達(dá)[6]。此外,采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)研究證明,在吉西他濱耐藥的非小細(xì)胞肺癌中MRP7的基因表達(dá)也明顯增高,基因組學(xué)研究表明,在乳腺癌細(xì)胞中MRP7的基因高表達(dá)是預(yù)測吉西他濱耐藥的重要指標(biāo)[7-8]。

    參芪扶正注射液是我國傳統(tǒng)扶正補(bǔ)氣藥物,主要成分是黨參和黃芪,具有益氣扶正、益肺健脾的功效[9-10]。近年臨床將參芪扶正注射液用于非小細(xì)胞肺癌的輔助治療,療效明顯。研究表明,參芪扶正注射液配合紫杉醇在治療非小細(xì)胞肺癌中可提高化療療效、減輕化療毒性;配合吉西他濱化療治療老年晚期非小細(xì)胞肺癌,能減輕化療的毒性和不良反應(yīng)[11-14],并通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的活性而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[15]。研究發(fā)現(xiàn),參芪扶正注射液可通過調(diào)節(jié)多藥耐藥基因(multidrug resistanct,MDR1)和肺耐藥蛋白(lung resistance protein,LRP)的蛋白表達(dá),改善非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥[16]。但參芪扶正注射液與紫杉醇和吉西他濱聯(lián)用提高療效的作用機(jī)制還有待研究。因此,本研究將建立紫杉醇和吉西他濱非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株,考察參芪扶正注射液對紫杉醇和吉西他濱在非小細(xì)胞肺癌耐藥方面的改善作用及其機(jī)制。

    1 儀器與試藥

    1.1儀器 HF-90型二氧化碳培養(yǎng)箱(中國力康生物科技公司);Tecan Mpro200多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);BSC-ⅡA2生物潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣有限公司)。

    1.2試藥 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549,購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum,F(xiàn)BS),購自GIBCO公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽和MTT,購自Sigma公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%;紫杉醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,批號325022),吉西他濱(質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%,批號BIFK0023),均購自北京百靈威科技有限公司;甲醇、乙腈均為分析純(美國Fisher公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    2 方法

    2.1紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞的建立 采用逐步增加藥物濃度的方法,持續(xù)刺激A549細(xì)胞,分別建立紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞,取對數(shù)生長期A549細(xì)胞,分別加入紫杉醇和吉西他濱使其作用濃度為1和3 nmol·L-1的低濃度持續(xù)作用于A549細(xì)胞,保證A549細(xì)胞在該藥物濃度下穩(wěn)定生長、傳代;待細(xì)胞適應(yīng)紫杉醇和吉西他濱并可穩(wěn)定增殖時(shí),增加紫杉醇和吉西他濱的作用濃度(3和5 nmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng),維持藥物濃度直至存活細(xì)胞能在此濃度下穩(wěn)定生長、傳代;2個(gè)月后獲得穩(wěn)定的紫杉醇和吉西他濱非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株[17]。

    2.2MTT法檢測紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞存活率 將紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞以2×104個(gè)·孔-1接種于96 孔板中,細(xì)胞貼壁后,在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中孵育24 h,后加入不同濃度的紫杉醇和吉西他濱并設(shè)置空白對照,每孔總體積為200 μL,孵育24 h后吸出培養(yǎng)基,每孔200 μL,各濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)12 h,用于MTT檢測;每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL,繼續(xù)孵育4 h,吸去MTT液;每孔加入200 μL DMSO,振蕩15 min,使DMSO充分溶解,在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值。

    2.3MTT法檢測參芪扶正注射液聯(lián)合紫杉醇和吉西他濱對耐藥A549細(xì)胞存活率的影響 將紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞以2×104個(gè)·孔-1接種于96孔板中,細(xì)胞貼壁后,在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中孵育24 h后,加入含有不同劑量的參芪扶正注射液的培養(yǎng)基及紫杉醇和吉西他濱并設(shè)置空白對照,每孔總體積為200 μL,孵育24 h后吸出培養(yǎng)基,每孔200 μL,各濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后,用于MTT檢測;每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL,繼續(xù)孵育4 h后,吸去MTT液;每孔加入200 μL DMSO,振蕩15 min,使DMSO充分溶解,在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值,以對照組吸光度值為對照,計(jì)算細(xì)胞相對存活率。

    2.4胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的濃度檢測 將A549細(xì)胞及耐藥A549細(xì)胞以5×106個(gè)·孔-1接種于6孔板中,細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)12 h,在含有10 nmol·L-1紫杉醇和20 nmol·L-1吉西他濱的培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h,用冷PBS緩沖液沖洗2次,以2 700 r·min-1離心5 min,然后用高效液相色譜儀測定細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的含量(濃度用測定每5×106個(gè)細(xì)胞中的紫杉醇和吉西他濱含量表示)。另外,測定聯(lián)合給予參芪扶正注射液后,細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的含量。紫杉醇色譜條件為:色譜柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:25 ℃;流動(dòng)相比例為水∶甲醇∶乙腈=25∶40∶35;流速:1 mL·min-1;檢測波長:254 nm[18-19]。吉西他濱檢測條件:色譜柱Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);炔諾酮為內(nèi)標(biāo);流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水=40∶30∶30;流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:227 nm;柱溫:40 ℃[20]。

    2.5Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中的MRP7 對數(shù)生長期的A549耐藥細(xì)胞(4×105個(gè)·mL-1)接種于6孔板中,其中每板設(shè)1孔陰性對照,其余4孔細(xì)胞貼壁后加入終濃度為60 mL·L-1的參芪扶正注射液,培養(yǎng)24 h后裂解、收集進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的分離膠中電泳,電泳后轉(zhuǎn)膜,2 h后蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜中,后將濾膜在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶中封閉1.5 h,加入MRP7一抗過夜(1∶500),再加入二抗(羊抗鼠辣根過氧化物酶)2 h,在室溫條件下孵育60 min。采用ECL顯色曝光,使用凝膠成像系統(tǒng)掃面分析,同時(shí)檢測GAPDH 蛋白作為內(nèi)參。

    3 結(jié)果

    3.1紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞對紫杉醇和吉西他濱的敏感度明顯降低 通過MTT實(shí)驗(yàn)證明紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞模型,低劑量紫杉醇和吉西他濱誘導(dǎo)建立的A549耐藥細(xì)胞株在同等紫杉醇和吉西他濱給藥劑量下(紫杉醇:1.25,2.5,5,10,20和40 nmol·L-1,吉西他濱:6.25,12.5,25,50,75和100 nmol·L-1),對A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的抑制率相對于正常A549細(xì)胞顯著降低,說明紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞造模成功,見圖1。

    3.2紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱含量明顯降低 采用HPLC法檢測A549細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱的含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。A549耐藥細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的濃度顯著降低,給予10 nmol·L-1的紫杉醇或25 nmol·L-1的吉西他濱后,正常A549細(xì)胞中每5×106個(gè)細(xì)胞中含有紫杉醇18.2±1.85和3.11±0.74 ng;A549耐藥細(xì)胞中每5×106個(gè)細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱含量分別為4.38±0.47和0.74±0.17 ng。耐藥細(xì)胞中紫杉醇及吉西他濱含量相對于正常A549細(xì)胞差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)。

    圖1非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及耐藥細(xì)胞抑制率

    A.正常A549細(xì)胞與紫杉醇耐藥細(xì)胞抑制率;B.正常A549細(xì)胞與吉西他濱耐藥細(xì)胞抑制率。(n=3)。

    Fig.1 The inhibition rate of normal cells and drug resistance cells

    A.the inhibition rate of normal A549 cells and paclitaxel drug resistance cells;B.the inhibition rate of normal A549 cells and gemcitabine drug resistance cells.(n=3).

    圖2細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱的含量

    A.正常細(xì)胞與紫杉醇耐藥細(xì)胞;B.正常細(xì)胞與吉西他濱耐藥細(xì)胞。*P<0.05,n=5。

    Fig.2 The content of paclitaxel and gemcitabine in cells

    A.normal cells and paclitaxel resistance cells;B.normal cells and gemcitabine resistance cells.*P<0.05,n=5.

    3.3參芪扶正注射液明顯提高紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞敏感性 在含有不同劑量的(5,15,30和60 mL·L-1)的參芪扶正注射液的培養(yǎng)基中,加入紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3,參芪扶正注射液對耐藥細(xì)胞無明顯抑制作用。將含有60 mL·L-1的參芪扶正注射液的培養(yǎng)液與不同濃度紫杉醇5 nmol·L-1(a)和20 nmol·L-1(b)單獨(dú)與聯(lián)合作用于A549紫杉醇耐藥細(xì)胞后,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。紫杉醇20 nmol·L-1組,細(xì)胞存活率為73.3%±7.5%,而參芪扶正注射液與等劑量紫杉醇聯(lián)用后,細(xì)胞存活率為52.7%±6.4%,與單一組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將含有60 mL·L-1的參芪扶正注射液的培養(yǎng)液與不同濃度吉西他濱單獨(dú)與聯(lián)合使用后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。吉西他濱20 nmol·L-1(a)和45 nmol·L-1(b)單一組細(xì)胞存活率分別為92.3%±4.5%和87.3%±4.6%,而等劑量吉西他濱與參芪扶正注射液聯(lián)用后,細(xì)胞存活率分別為80.6%±6.4%和74.7%±4.4%,與單一吉西他濱組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    圖3參芪扶正注射液對A549耐藥細(xì)胞抑制率

    A.紫杉醇耐藥A549細(xì)胞;B.吉西他濱耐藥A549細(xì)胞(n=5)。

    Fig.3 The inhibitory rate of Shenqi Fuzheng Injections on resistant A549 cells

    A.paclitaxel resistant A549 cells;B.gemcitabine resistant A549 cells (n=5).

    圖4參芪扶正注射液提高紫杉醇在紫杉醇耐藥A549細(xì)胞中的敏感性

    注:*P<0.05 vs紫杉醇20 nmol·L-1,n=5。

    Fig.4 Shenqi Fuzheng Injections improved the sensitivity of paclitaxel in paclitaxel-resistant A549 cells

    Note:*P<0.05 vs paclitaxel 20 nmol·L-1,n=5.

    圖5參芪扶正注射液提高吉西他濱在吉西他濱耐藥A549細(xì)胞中的敏感性

    注:*P<0.05,n=5。

    Fig.5 Shenqi Fuzheng Injections improved the sensitivity of gemcitabine in gemcitabine-resistant A549 cells

    Note:*P<0.05,n=5.

    3.4參芪扶正注射液明顯增加紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱濃度 檢測細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱含量,結(jié)果顯示,紫杉醇和吉西他濱與參芪扶正注射液聯(lián)合使用后,紫杉醇耐藥A549細(xì)胞中每5×106個(gè)細(xì)胞內(nèi)含有紫杉醇7.20±1.27 ng,吉西他濱耐藥A549細(xì)胞中每5×106個(gè)細(xì)胞內(nèi)含有吉西他濱1.5±0.41 ng;與單一給藥組比較,每5×106個(gè)細(xì)胞內(nèi)分別含有紫杉醇和吉西他濱4.38±0.47和0.74±0.17 ng,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05),見圖6。

    圖6參芪扶正注射液提高紫杉醇和吉西他濱耐藥A549細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱的含量

    注:*P<0.05 vs單一給藥,n=5。

    Fig.6 Shenqi Fuzheng Injections enhanced the content of paclitaxel and gemcitabine in paclitaxel or gemcitabine-resistant A549 cells.

    Note:*P<0.05 vs single drug,n=5.

    3.5參芪扶正注射液明顯抑制紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞中的MRP7表達(dá) Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,紫杉醇和吉西他濱誘導(dǎo)的A549耐藥細(xì)胞中MRP7明顯升高,但給予參芪扶正注射液可顯著降低耐藥細(xì)胞中MRP7表達(dá),見圖7。

    圖7參芪扶正注射液對紫杉醇和吉西他濱誘導(dǎo)的A549耐藥細(xì)胞中MRP7的影響

    注:與正常A549細(xì)胞比較,**P<0.01;與耐藥A549細(xì)胞比較,*P<0.05,n=3。

    Fig.7 The effect of Shenqi Fuzheng Injections on MRP7 in paclitaxel or gemcitabine-induced multidrug resistance A549 cells

    Note:compared with normal A549 cells,**P<0.01;compared with drug resistant A549 cells,*P<0.05,n=3.

    4 討論

    腫瘤細(xì)胞多藥耐藥是臨床腫瘤治療面臨的重要問題,紫杉醇和吉西他濱是臨床非小細(xì)胞肺癌治療的主要用藥,而耐藥是導(dǎo)致紫杉醇和吉西他濱臨床治療失敗的主要原因。近期研究發(fā)現(xiàn),MRP7在紫杉醇和吉西他濱等非鉑類腫瘤藥物的耐藥中具有重要作用,可減少腫瘤細(xì)胞中腫瘤藥物濃度和腫瘤藥物細(xì)胞毒性作用。本研究通過建立非小細(xì)胞肺癌紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞株,表明紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞對紫杉醇和吉西他濱敏感性顯著降低,其中MRP7蛋白表達(dá)升高,通過HPLC法檢測胞內(nèi)紫杉醇和吉西他濱含量,結(jié)果表明,2種腫瘤藥物在細(xì)胞中的含量顯著降低;但將參芪扶正注射液與紫杉醇和吉西他濱聯(lián)合給藥后,在紫杉醇和吉西他濱耐藥劑量下,可提高該劑量下對細(xì)胞增殖的抑制作用;提高細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱含量,降低耐藥細(xì)胞中MRP7的表達(dá)。

    化療在非小細(xì)胞肺癌NSCLC的治療中至關(guān)重要,而多藥耐藥是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。MRP7是新近發(fā)現(xiàn)的ATP結(jié)合盒式蛋白(ATP-bindingcassette transporter,ABC)家族C族成員,報(bào)道顯示,ABC家族膜轉(zhuǎn)運(yùn)體在MDR中起主要作用,MRP7通過外排功能導(dǎo)致化療藥物從腫瘤細(xì)胞中向外排出細(xì)胞,導(dǎo)致化療藥物靶濃度減少,療效降低。早期研究發(fā)現(xiàn),MRP7在紫衫醇耐藥中發(fā)揮著重要作用,但在吉西他濱的耐藥中存在爭議,近期研究發(fā)現(xiàn),采用MRP7抑制劑千金藤素作用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞可明顯提高吉西他濱的療效[7],此外基因組學(xué)研究表明,MRP7的高表達(dá)在吉西他濱腫瘤耐藥中是重要預(yù)測指標(biāo)[8]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),參芪扶正注射液對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞MRP7具有一定的抑制作用,可提高腫瘤細(xì)胞中紫杉醇和吉西他濱的含量。因此,參芪扶正注射液提高腫瘤患者的化療效果與抑制MRP7具有一定的關(guān)系。而紫杉醇和吉西他濱腫瘤耐藥的作用機(jī)制復(fù)雜,與多藥耐藥蛋白家族及P-糖蛋白、微管蛋白和熱休克蛋白基因等均有關(guān)系[21-22],因此針對參芪扶正注射液對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇和吉西他濱耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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