共水蒸餾當(dāng)歸川芎揮發(fā)油工藝優(yōu)化及隔水蒸餾GC-MS的比較

齊 菲，楊范莉，史亞軍，崔春利，鄒俊波，張小飛

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，西安 712046；2.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

中藥藥對是臨床上常用的配伍形式，雖然組成相對簡單，但它具有中藥配伍的基本特點(diǎn)[1]。藥對配伍是研究復(fù)方配伍規(guī)律的基礎(chǔ)和重要切入點(diǎn)之一，了解藥對配伍的化學(xué)成分變化，有利于闡述復(fù)方中藥配伍的機(jī)制[2-4]。當(dāng)歸、川芎伍用，名曰佛手散，又名芎歸散，出自《普濟(jì)本事方》，主治妊娠傷胎、難產(chǎn)、胞衣不下等。《醫(yī)宗金鑒》云：“命名不曰歸芎，而曰佛手者，謂婦人胎前、產(chǎn)后諸癥如佛手之神妙也。當(dāng)歸、川芎為血分之主藥，性溫而味甘辛，以溫能活血，甘能補(bǔ)血，辛能散血也?！碑?dāng)歸川芎配對可協(xié)同增強(qiáng)養(yǎng)血活血、活血袪瘀及調(diào)經(jīng)止痛的功效，是臨床常用的養(yǎng)血活血藥對。當(dāng)歸和川芎藥材均含揮發(fā)油，文獻(xiàn)報(bào)道[5]，當(dāng)歸和川芎的揮發(fā)油成分是這2種中藥的有效成分之一。

提取揮發(fā)油最常用的是水蒸氣蒸餾法[6]。到目前為止，實(shí)驗(yàn)室多用共水蒸餾，工業(yè)上生產(chǎn)以隔水蒸餾為主，后者是安裝一塊多孔的隔板，將中藥置于板上，水放在板下，水面距離板有相當(dāng)距離。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理和方法[7-11]，確定共水蒸餾提取藥對揮發(fā)油的最佳工藝條件，利用GC-MS[12-13]分析共水蒸餾與隔水蒸餾單味藥與藥對及配伍前后的揮發(fā)油成分變化，比較2種方法提取揮發(fā)油，并為闡釋藥對當(dāng)歸川芎物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀(GC-MS，美國Agilent公司)；分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；中藥粉碎機(jī)(QE-400克，浙江屹立工貿(mào)有限公司)；揮發(fā)油提取器(鄭州市中原區(qū)興華玻璃儀器廠)；MH型電子調(diào)溫電熱套(科偉電熱儀器有限公司)。

1.2試藥 當(dāng)歸、川芎飲片(陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；正己烷(色譜純，批號20170815)，無水硫酸鈉(分析純，批號20170320)，均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1藥對當(dāng)歸川芎揮發(fā)油的提取方法 分別將當(dāng)歸、川芎藥材粉碎過篩，精密稱取藥材粉末各30 g，根據(jù)《中國藥典》2015年版四部通則2204，采用共水蒸餾法進(jìn)行揮發(fā)油提取，精密測定揮發(fā)油體積，計(jì)算揮發(fā)油得率。

2.2供試品溶液的制備 在揮發(fā)油中分別加入無水硫酸鈉除水，精密吸取除過水的揮發(fā)油各0.1 mL，置于10 mL量瓶中，用正己烷定容,即得。

2.3揮發(fā)油的測定條件

2.3.1色譜條件 色譜分離采用HP-5MS毛細(xì)管色譜柱，載氣為氦氣，以1 mL·min-1恒定的流速通過HP-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：310 ℃；柱溫程序：100 ℃，保持3 min，以3 ℃·min-1升至170 ℃，再以2 ℃·min-1升至210 ℃，再以8 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min。

2.3.2質(zhì)譜條件 離子源：電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度：280 ℃；接口溫度：280 ℃；四級桿溫度：150 ℃；檢測電壓：70 eV；質(zhì)量掃描范圍(m/z):40～700 amu。

2.4揮發(fā)油的GC-MS分析 將2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液按照2.3項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，得到總離子流圖，見圖2。采用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索并進(jìn)行比對，應(yīng)用峰面積歸一化法計(jì)算揮發(fā)油中各化學(xué)成分的相對百分含量[14-18]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1單因素實(shí)驗(yàn) 以不同的提取時(shí)間、料液比和浸泡時(shí)間3個(gè)因素為指標(biāo)，考察3個(gè)不同條件下?lián)]發(fā)油得率和藥對提取的條件。

3.1.1共水蒸餾提取時(shí)間對藥對揮發(fā)油得率的影響 每次實(shí)驗(yàn)取藥對粗粉60 g，在料液比1∶10和浸泡1 h的條件下，按照2.1項(xiàng)下方法提取，提取時(shí)間選取2，4，6，8和10 h 5個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，提取時(shí)間在8 h時(shí)揮發(fā)油得率不再明顯增高，故以8 h作為提取時(shí)間。

3.1.2料液比對藥對揮發(fā)油得率的影響 每次實(shí)驗(yàn)取藥對粗粉60 g，浸泡1 h提取8 h的條件下，按照2.1項(xiàng)下方法提取，料液比選取1∶4,1∶6,1∶8,1∶10和1∶12進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出料液比為1∶10時(shí)揮發(fā)油得率最高，故以1∶10作為料液比。

3.1.3浸泡時(shí)間對藥對揮發(fā)油得率的影響 每次實(shí)驗(yàn)取藥對粗粉60 g，在提取8 h，料液比為1∶10的條件下，按照2.1項(xiàng)下方法提取，浸泡時(shí)間選取0，0.5，1，1.5和2 h 5個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果浸泡1 h時(shí)揮發(fā)油得率最高，故以1 h作為浸泡時(shí)間。

3.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

3.2.1Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化共水蒸餾提取揮發(fā)油工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響藥對揮發(fā)油提取工藝的3個(gè)因素：提取時(shí)間(X1)、浸泡時(shí)間(X2)和料液比(X3)為考察對象，以藥對揮發(fā)油提取率(%)為評價(jià)指標(biāo)，采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化藥對揮發(fā)油提取工藝，因素水平見表1，提取工藝參數(shù)實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表1響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of response surface analysis experiment

編碼水平因素低(-1)中(0)高(1)提取時(shí)間(X1)/h6810浸泡時(shí)間(X2)/h0.511.5料液比(X3)/g·mL-11∶81∶101∶12

表2響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Experimental results of the response surface analysis

序號提取時(shí)間(X1)/h浸泡時(shí)間(X2)/h料液比(X3)/g·mL-1揮發(fā)油提取率/%10-110.6421-100.6030-1-10.494-1-100.4050110.5360000.637-1100.468-1010.5591010.52100000.6211-10-10.33120000.631301-10.50140000.63151100.57160000.631710-10.66

3.2.2建立模型方程與顯著性檢驗(yàn) 利用軟件Design Expert 8.0.6對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到揮發(fā)油得率與各因素變量的二次方程模型：Y(%)=0.628 0+0.076 250×A-0.008 75×B+0.032 5×C-0.022 5×A×B-0.09×A×C-0.03×B×C-0.072 75×A2-0.047 750×B2-0.040 250×C2，對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

該方程的相關(guān)系數(shù)r=0.987 6，接近于1，從擬合方程的相關(guān)系數(shù)可知，多元二次項(xiàng)擬合方程r較高，且實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚉<0.000 1，結(jié)果表明，回歸方程模型擬合度好。

表3回歸模型方差分析結(jié)果

Tab.3 Variance analysis results of regression model

方差來源平方和自由度均差FP常數(shù)項(xiàng)0.1490.01530.72<0.000 1 A-A0.04710.04794.24<0.000 1 B-B0.000 612 510.000 612 51.240.302 1 C-C0.008 4510.008 45017.120.004 4 AB0.002 02510.002 0254.100.082 5 AC0.03210.03265.64<0.000 1 BC0.003 610.003 67.290.030 6 A^20.02210.02245.150.000 3 B^20.009 610.009 619.450.003 1 C^20.006 82110.006 82113.820.007 5殘差0.003 45570.000 493 6失擬項(xiàng)0.003 37530.001 12556.250.001 0純誤差0.000 0840.000 05總和0.1416

由表3可知，提取時(shí)間和料液比對藥對揮發(fā)油提取率影響較為顯著，二次項(xiàng)、交互項(xiàng)交互對揮發(fā)油提取的曲面效應(yīng)極顯著。失擬項(xiàng)F值為0.406，表明失擬項(xiàng)相對于絕對誤差不顯著，而不顯著的失擬項(xiàng)是可取的，說明該回歸方程對實(shí)驗(yàn)擬合情況較好，該模型能較好地描述實(shí)驗(yàn)。

3.2.3響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對因素A、B、C所構(gòu)成的三維空間曲面圖，從響應(yīng)面圖上可看出各參數(shù)之間的相互作用，結(jié)果見圖1。由圖1可知，提取時(shí)間和浸泡時(shí)間之間的交互作用較為顯著。沿A軸的等高線密度變化相對沿B軸的變化較大，說明提取時(shí)間對揮發(fā)油得率的影響比浸泡時(shí)間的影響大。

3.2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)軟件Design Expert 8.0.6分析，藥對揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為提取時(shí)間8 h，料液比為1∶8，浸泡時(shí)間為0.5 h，藥對揮發(fā)油得率的理論值可達(dá)0.689%。實(shí)際測得的揮發(fā)油得率為0.66%，RSD值為0.87%，與理論值相符，因此基于響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝條件準(zhǔn)確可靠。

3.3隔水蒸餾提取藥對揮發(fā)油 用響應(yīng)面優(yōu)化的最優(yōu)條件，用隔水蒸餾提取當(dāng)歸川芎揮發(fā)油，平均提取率為0.63%±1.59%(n=3)。

3.4GC-MS結(jié)果分析 見圖2和表4。

圖1響應(yīng)面曲線圖

Fig.1 The response surface curve

圖2總離子流圖

A.共水蒸餾當(dāng)歸離子流圖；B.隔水蒸餾當(dāng)歸離子流圖；C.共水蒸餾川芎離子流圖；D.隔水蒸餾川芎離子流圖；E.共水蒸餾當(dāng)歸川芎離子流圖；F.隔水蒸餾當(dāng)歸川芎離子流圖。

Fig.2 The graph of total ion current

A.common water distillation ofAngelicasinensis(Oliv.) Diels；B.separated water distillation ofAngelicasinensis(Oliv.) Diels；C.common water distillation ofLigusticumchuanxiongHort；D.separated water distillation ofLigusticumchuanxiongHort；E.common water distillation ofAngelicasinensis(Oliv.) Diels andLigusticumchuanxiongHort；F.separated water distillation ofAngelicasinensis(Oliv.) Diels andLigusticumchuanxiongHort.

表4化學(xué)分析結(jié)果

Tab.4 The results of chemical analysis

序號保留時(shí)間化合物分子式相對百分含量/%共水當(dāng)歸共水川芎共水當(dāng)歸川芎隔水當(dāng)歸隔水川芎隔水當(dāng)歸川芎13.6683-careneC10H160.9124.046γ-terpineneC10H160.8134.6121-methyl-4-(1-methylethylidene)-cyclohexeneC10H160.6845.338 (E,Z)-2, 2,6-dimethyl-4,6-octatrieneC10H160.6756.0215-pentylcyclohexa-1,3-dieneC11H180.8566.297endo-borneolC10H18O?0.5976.544(R)-4-methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-olC10H18O2.751.16?1.0389.666acetic acid,1,7,7-trimethyl-bicyclo[2.2.1]hept-2-yl esterC12H20O22.48910.5092-methoxy-4-vinylphenolC9H10O21.081.260.78?0.791013.529[3aR-(3aα,4β,7α)]-2,4,5,6,7,8-hexahydro-1,4,9,9-tetramethyl-3H-3a,7-methanoazuleneC15H24?4.691116.71[4aR-(4aα,7α,8aβ)]-decahydro-4a-methyl-1-methyl-ene-7-(1-methylethenyl)-naphthaleneC15H242.230.830.69?1.441219.992[1aR-(1aα,4aα,7β,7aβ,7bα)]-decahydro-1,1,7-trim-ethyl-4-methylene-1H-cycloprop[e]azulen-7-olC15H24O1.461.171.310.851.23?1.171322.5923-butylisobenzofuran-1(3H)-oneC12H14O22.104.353.554.13?4.081422.6932-((2S,4aR)-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7-octa-hydronaphthalen-2-yl)propan-2-olC15H26O1.911523.3763-butylidene-1(3H)-isobenzofuranoneC12H12O28.457.507.047.997.571623.5798-isopropyl-1,5-dimethyltricyclo[4.4.0.02,7]dec-4-en-3-oneC15H22O6.741723.6381H-2-indenone,2,4,5,6,7,7a-hexahydro-3-(1-meth-ylethyl)-7a-methylC13H20O2.041824.0595-pentylcyclohexa-1,3-dieneC11H181.761.36?1.081924.160(3aR,4R,7R)-1,4,9,9-tetramethyl-3,4,5,6,7,8-hexahydro-2H-3a,7-methanoazulen-2-oneC15H22O4.36?1.692024.944Z-butylidenephthalideC12H12O21.831.941.850.952125.148senkyunolideC12H16O21.173.0419.311.2213.282225.249p-cresyl isovalerateC12H16O216.272425.714(E)-3-butylidene-4,5-dihydroisobenzofuran-1(3H)-oneC12H14O280.857.0561.0258.8274.3357.472527.631(E)-3-butylidene-4,5-dihydroisobenzofuran-1(3H)-oneC12H14O24.181.582.822.354.07

由表4可知，當(dāng)歸川芎揮發(fā)油化學(xué)成分種類較多。揮發(fā)油主要成分均為藁苯內(nèi)酯，其含量最高。兩者均含有Z-正丁烯基苯酞，但當(dāng)歸揮發(fā)油中的含量高于川芎揮發(fā)油，且共水大于隔水。在當(dāng)歸、川芎揮發(fā)油中檢測到苯酞類、萜類和脂肪酸類等成分，其含量見圖3。由圖3可知，苯酞類含量較高。整體來看，共水蒸餾的含量大于隔水蒸餾的含量，但隔水蒸餾川芎中藁本內(nèi)酯含量高于共水蒸餾；脂肪酸類成分，隔水蒸餾當(dāng)歸川芎的含量大于共水蒸餾當(dāng)歸川芎，隔水蒸餾提取藥對藁本內(nèi)酯含量下降，但脂肪酸類含量增多。

圖3各類成分含量

Fig.3 The content of various components

4 討論

4.1揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化 應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面法對當(dāng)歸川芎藥對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)測藥對揮發(fā)油提取率與預(yù)測值基本一致。通過對藥對揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到藥對揮發(fā)油的最佳提取工藝，所得結(jié)果提取率高、重復(fù)性好。但揮發(fā)油的提取不僅要重視得率，還應(yīng)觀察揮發(fā)油的化學(xué)成分和生物藥效的變化。

4.2揮發(fā)油GC-MS分析 通過共水蒸餾和隔水蒸餾提取中藥揮發(fā)油，共水蒸餾是將含有揮發(fā)性成分的藥材與水共同蒸餾，使揮發(fā)性成分隨水蒸氣一并餾出，中藥在水中浸泡時(shí)間長，因此芳香性物質(zhì)會有一部分留在水中，不能被提取出來。隔水蒸餾對芳香性物質(zhì)較易蒸餾，可加快蒸餾速度，中藥沒有在水中浸泡，因此對芳香性物質(zhì)損失較少。結(jié)果表明，共水蒸餾得到揮發(fā)油的含量、種類高于隔水蒸餾，有可能是藥材在水中浸泡，溶出其他物質(zhì)所得。

當(dāng)歸和川芎都為傘形科，所含化學(xué)物質(zhì)有許多相似的，主要功效物質(zhì)為藁本內(nèi)酯和芳香酸類成分，這2類物質(zhì)對心腦血管系統(tǒng)和免疫功能有很好的調(diào)節(jié)作用[19]。當(dāng)歸治療痛經(jīng)的效果優(yōu)于川芎，但川芎治療血瘀頭痛的效果優(yōu)于當(dāng)歸；當(dāng)歸具有潤腸通便、抗輻射損傷的作用，但川芎沒有，川芎具有解熱作用，但當(dāng)歸卻沒有[20-21]，2種藥材可優(yōu)勢互補(bǔ)。GC-MS分析中，隨著程序升溫，溫度升高，所得化合物相對分子質(zhì)量變大，成分變復(fù)雜。藥對提取揮發(fā)油具有加和性，但并非簡單加和，與單味藥比較，當(dāng)歸和川芎藥物配伍使揮發(fā)油含量增加，為后續(xù)研究比較提取單味藥揮發(fā)油與藥對揮發(fā)油成分差異提供依據(jù)。