肝癌組織中血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)水平及影響因素分析

范秀平，張春燕，李曉輝

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 成都 610500)

肝癌是臨床常見惡性腫瘤，起病隱匿，進(jìn)展速度快，惡性程度高，術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差[1]。且肝癌屬典型多血管腫瘤，血管生成在肝癌發(fā)病及進(jìn)展中有重要作用，同時也是引起肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的關(guān)鍵原因。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與肝癌血管生成相關(guān)度較高，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，引起內(nèi)皮細(xì)胞分化，提升血管通透性，提升蛋白水解酶活性，促進(jìn)腫瘤新生血管生成[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤細(xì)胞生成、遷移及侵襲過程中有重要作用[3]。早期研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、結(jié)直腸癌患者癌組織VEGF陽性率較高[4]，但目前對肝癌患者VEGF表達(dá)情況的變化及其機(jī)制少見報道。本文探討肝癌癌組織VEGF表達(dá)情況及其影響因素，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2015年1月至2017年5月我院接受手術(shù)治療的80例肝癌患者，均經(jīng)病理證實為肝癌，術(shù)前未接受放化療及介入治療。其中男51例，女39例；年齡39～79歲[(62.4±5.7)歲]；分化程度：高分化20例，中分化35例，低分化25例；肝癌TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期44例，Ⅲ期27例；肝功能Child-Pugh分級：A級45例，B級35例；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。并收集其中40例距肝癌組織2 cm以上癌旁組織標(biāo)本，均經(jīng)病理證實無腫瘤細(xì)胞浸潤，未見增生性病變。

1.2主要試劑與儀器鼠抗人VEGF免疫組化單克隆抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，四元羧酸乙二胺四乙酸(EDTA)組織抗原修復(fù)液(購自北京金橋生物科技有限公司)，免疫組化試劑盒(辣根過氧化物酶標(biāo)記工作液、生物素標(biāo)記通用型免疫蛋白G(IgG))(上海新肽生物科技有限公司)；Nikon YS100型光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)，11-2R型電熱恒溫水浴箱(南京醫(yī)療器械廠)，RM2145型切片機(jī)(德國Leica公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海醫(yī)療器械三公司)，TS-12C型自動脫水機(jī)(湖北電子儀器廠)，Z323K高速冷凍離心機(jī)(德國Hermle公司)。

1.3方法采用免疫組化法測定肝癌癌組織、癌旁組織VEGF表達(dá)。石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，厚度4 μm，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS洗滌3次×3 min，3%過氧化氫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次×3 min，EDTA高壓修復(fù)2 min，室溫冷卻，PBS沖洗3次×3 min，動物血清封閉，室溫孵育10 min，滴入鼠抗人VEGF單克隆抗體，4 ℃低溫過夜，PBS沖洗3次×3 min，滴生物素標(biāo)記IgG，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次×3 min，滴入DAB顯色液顯色，返藍(lán)10 min，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，清水沖洗，酒精分化，返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察染色情況。

1.4判斷標(biāo)準(zhǔn)VEGF陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕褐色顆粒。每張切片均選取5個高倍視野進(jìn)行觀察，應(yīng)用半定量積分法評定染色結(jié)果，著色強(qiáng)度：無著色為0分；黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例：低于5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。陽性細(xì)胞比例評分×著色強(qiáng)度評分為最終評分，陰性為0分；弱陽性為1～4分；中度陽性為5～8分；強(qiáng)陽性為9～12分。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肝癌組織與癌旁組織VEGF表達(dá)情況比較肝癌組織VEGF表達(dá)陽性率高于癌旁組織，且中度陽性、強(qiáng)陽性比例高于癌旁組織，弱陽性比例低于癌旁組織(P< 0.05)，見表1。肝癌組織VEGF陽性產(chǎn)物為棕褐色、淡黃色顆粒，主要表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)，呈彌散分布，在肝癌組織肝細(xì)胞索與血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)間隙肝竇細(xì)胞內(nèi)呈弱表達(dá)，癌組織VEGF陽性分布及著色程度不均(圖1a)；癌旁組織VEFG表達(dá)水平較低，著色淺(圖1b)。

表1 肝癌組織與癌旁組織VEGF表達(dá)情況比較 [n(%)]

圖1 組織VEGF表達(dá)(HE×100) a:肺癌組織；b.癌旁組織

2.2不同臨床病理參數(shù)肝癌組織VEGF表達(dá)情況比較不同分化程度、不同TNM分期、不同肝功能分級、是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者VEGF陽性率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，腫瘤低分化患者VEGF陽性率高于高分化者，高TNM分期、肝功能分級及合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌患者癌組織VEGF陽性率較高(P< 0.05)，見表2。

2.3肝癌組織VEGF表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系肝癌組織VEGF表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，與TNM分期、肝功能分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)度最高(P< 0.05)，見表3。

表2 不同臨床病理參數(shù)肝癌患者癌組織VEGF表達(dá)情況比較[n(%)]

表3 肝癌癌組織VEGF表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

肝癌起病隱匿，大部分患者發(fā)病初期均無特異性癥狀表現(xiàn)，確診時已進(jìn)展至中晚期，部分發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)根治效果差，術(shù)后復(fù)發(fā)率高[5，6]。而浸潤及轉(zhuǎn)移為惡性腫瘤的共同特點(diǎn)，是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素。而腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移過程通常受多因素影響[7]，明確其相關(guān)影響因素則可為患者預(yù)后改善奠定基礎(chǔ)。VEGF系特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能的蛋白，可選擇性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜絡(luò)氨酸激酶受體，加速內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及微血管形成，加快內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞遷移速度，上調(diào)間質(zhì)膠原酶、蛋白水解酶表達(dá)[8]。早期研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌患者均可見VEGF表達(dá)上調(diào)，提示VEGF在惡性腫瘤發(fā)病過程中有重要作用[9，10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，人肝細(xì)胞肝癌中VEGF及血管生成素均可促進(jìn)腫瘤血管生成及腫瘤進(jìn)展[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織VEGF表達(dá)陽性率明顯高于癌旁組織，與熊建寧等[12]結(jié)論相符，提示肝癌發(fā)病過程中VEGF發(fā)揮重要的作用。血管生成是腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，血管生成可為腫瘤生長及增殖提供必要的營養(yǎng)支持，為癌細(xì)胞提供充足的血液供應(yīng)，同時是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的重要途徑，可導(dǎo)致癌細(xì)胞血管滲透，促進(jìn)其進(jìn)入血循環(huán)，發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。且VEGF可降解血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)，削弱血管屏障作用，加重血管基底膜缺損，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。而肝癌為富血供腫瘤，其生長、增殖及轉(zhuǎn)移均有賴于VEGF的調(diào)控，細(xì)胞表面VEGF表達(dá)上調(diào)，腫瘤血管生成對肝癌生物學(xué)行為及侵襲性、增殖活躍性均產(chǎn)生重要的影響[14]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肝癌組織VEGF表達(dá)水平受腫瘤分化程度、肝癌TNM分期、肝功能分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，提示VEGF表達(dá)與肝癌生物學(xué)行為存在密切關(guān)聯(lián)，一般腫瘤分化程度越低，提示惡性程度高，腫瘤新生血管生成多，預(yù)后差。而肝癌TNM分期及肝功能分級越高的患者肝功能受損較為嚴(yán)重，腫瘤侵襲性越強(qiáng)，癌細(xì)胞生長速度快，可引起局部缺氧，導(dǎo)致癌細(xì)胞分泌大量VEGF，促進(jìn)新生血管生成，造成癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。此外，肝癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與淋巴管結(jié)構(gòu)存在關(guān)聯(lián)，淋巴管管腔大，管壁薄，且不規(guī)則，當(dāng)毛細(xì)淋巴外周組織受腫瘤侵犯時，淋巴管通透性提升，滲出增加，外周組織壓力上升，開放內(nèi)皮細(xì)胞連接，導(dǎo)致癌細(xì)胞進(jìn)入淋巴管，并向管腔內(nèi)聚集，沿低阻區(qū)域蔓延、浸潤，導(dǎo)致淋巴結(jié)受累[15]。而VEGF主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，對淋巴結(jié)管內(nèi)皮細(xì)胞有較強(qiáng)的趨化作用，VEGF過度表達(dá)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及淋巴管生成，直接引起腫瘤侵襲淋巴結(jié)并發(fā)生轉(zhuǎn)移[16]。此外，VEGF可于肝癌細(xì)胞膜受體結(jié)合，促進(jìn)腫瘤增殖；同時其作用于癌細(xì)胞后可降低其間質(zhì)粘附性，促使癌栓分離及脫落，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。另外，VEGF可提升腫瘤血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量基質(zhì)降解蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，提升血管通透性，促進(jìn)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移。

綜上，肝癌組織VEGF表達(dá)陽性率高，且其表達(dá)水平受病理因素的影響，包括腫瘤分化程度、TNM分期、肝功能分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，在肝癌侵襲及轉(zhuǎn)移過程中有重要作用。