UPLC-MS/MS法測定對乙酰氨基酚栓的含量

蔣志濤，呂玲燕，王 雪，陳曉峰，余 輝，邢國良

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬張家港醫(yī)院，江蘇省企業(yè)研究生工作站，張家港 215600)

對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)又稱為撲熱息痛，化學(xué)名為N-(4-羥基苯基)乙酰胺，分子式為C8H9NO2，由對硝基酚鈉經(jīng)還原成對氨基酚，再酰化制得，是大多數(shù)解熱鎮(zhèn)痛藥中的主要成分[1-3]。對乙酰氨基酚栓呈乳白色至微黃色，具有解熱鎮(zhèn)痛的作用，多用于感冒引起的發(fā)熱、神經(jīng)痛、偏頭痛、頭痛、關(guān)節(jié)痛、痛經(jīng)、癌痛及手術(shù)后止痛等[4-5]。近年來越來越多的研究報(bào)道，過量使用對乙酰氨基酚會造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如引起人們較多關(guān)注的肝毒性[6-9]，隨著我國肝臟疾病發(fā)生率的逐年增高，過量使用APAP會加重肝臟負(fù)擔(dān)，造成不同程度的肝損傷，為了減少該事件的發(fā)生率，對含有APAP的藥物進(jìn)行含量測定顯得尤為重要。對乙酰氨基酚栓收錄在《中國藥典》2015年版二部中，目前對其含量測定多采用紫外-可見分光光度法[10-11]，本文利用UPLC-MS/MS方法，進(jìn)行對乙酰氨基酚成分的含量測定，并簡單評估該藥品的質(zhì)量。此分析方法快速、省時(shí)、準(zhǔn)確度高、精密度好、靈敏度高，有利于更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，為用藥安全提供保證。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ACQUITY型超高效液相系統(tǒng)(美國Waters公司，包括自動進(jìn)樣器、四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)，Xevo TQ檢測器以及MassLynxTM 質(zhì)譜工作站軟件)；AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Drict-Q5超純水機(jī)(法國Millipore公司)；SCQ-250超聲波清洗器(上海盛普機(jī)械制造有限公司)。

1.2試藥 對乙酰氨基酚對照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%(批號SJ0711GA14)，購自上海源葉生物科技有限公司。對乙酰氨基酚栓購自湖北成田制藥股份有限公司(批號：161002，170204，170509)，規(guī)格為0.15 g。實(shí)驗(yàn)用水為超純水；流動相用甲醇為色譜純(德國Merck公司)；乙酸銨,分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸，分析純，購自南京化學(xué)試劑股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱：ACQUITYTMUPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨(含2 mL·L-1乙酸)(65∶35)；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。離子源：ESI；離子化模式：正離子檢測模式；定量模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，對乙酰氨基酚m/z152→110，錐孔電壓：55 V，碰撞能量：35 V。檢測電壓:3.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣流量：500 L·h-1；脫溶劑氣溫度：350 ℃。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液 精密稱取對乙酰氨基酚對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.128 mg·mL-1的對照品儲備液。精密量取上述儲備液1 mL，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液，將對照品溶液置于4 ℃條件下保存，待用。

2.2.2供試品溶液 取本品10粒，切成小片，精密稱取適量(相當(dāng)于對乙酰氨基酚150 mg)，置于100 mL量瓶中，加入適量甲醇超聲處理30 min使其充分溶解，自然冷卻后用甲醇定容，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液100 μL，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備的對照品溶液和供試品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件，所測對乙酰氨基酚的MRM色譜圖見圖1。結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液在相應(yīng)位置出峰，且在對乙酰氨基酚保留時(shí)間處無干擾色譜峰，所選擇的分析方法專屬性好。

2.4線性關(guān)系、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為5.8，58，290，1 550，2 900和5 800 ng·mL-1的系列對照品溶液，分別進(jìn)樣2 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以對乙酰氨基酚對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=90.034x+18 260，r=0.995 7，結(jié)果表明，對乙酰氨基酚質(zhì)量濃度在 5.8～5 800 ng·mL-1范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。以信噪比S/N=10時(shí)對照品質(zhì)量濃度作為定量限(LOQ)，對乙酰氨基酚的定量限為5.8 ng·mL-1?？疾旖Y(jié)果顯示，對照品溶液線性關(guān)系良好，儀器檢測靈敏度高，適合對乙酰氨基酚栓的定量分析。

2.5精密度考察 精密量取2.4項(xiàng)下制備的質(zhì)量濃度分別為58，1 550和5 800 ng·mL-1的對乙酰氨基酚對照品溶液，分別作為低、中、高質(zhì)量濃度水平，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別于1 d內(nèi)和連續(xù)3 d內(nèi)測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果表明，日內(nèi)精密度的RSD值均小于2.1%，日間精密度的RSD值均小于2.6% (n=6)，結(jié)果表明該方法精密度良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1MRM色譜圖

A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.對乙酰氨基酚。

Fig.1 MRM chromatograms

A.reference substance；B.samples；C.negative control；1.acetaminophen.

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品(批號170509)6份，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測得對乙酰氨基酚峰面積的RSD值為 1.7% (n=6)，均符合規(guī)定，結(jié)果表明，該測定方法的重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品(批號170509)適量，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，將供試品溶液置于4 ℃冰箱中保存，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別于放置0，2，4，6，8，10，12和24 h后進(jìn)樣分析，計(jì)算得對乙酰氨基酚峰面積的RSD值為1.8% (n=6)，結(jié)果表明，被測成分在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的對乙酰氨基酚栓樣品(批號170509) 6 份，每份相當(dāng)于對乙酰氨基酚150 mg，置于100 mL量瓶中，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份取續(xù)濾液1 mL，置于50 mL量瓶中，分別精密加入對乙酰氨基酚對照品儲備液0.5 mL，分別取2 μL注入液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析測定[12-15]，計(jì)算對乙酰氨基酚栓的平均回收率為99.2%，RSD值為2.0%，結(jié)果表明，該方法回收率良好，準(zhǔn)確可靠。見表1。

2.9樣品的含量測定 精密稱取3個(gè)不同批號的對乙酰氨基酚栓樣品(批號：161002，170204，170509)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣2 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析測定3次，利用已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算3個(gè)批號對乙酰氨基酚栓中對乙酰氨基酚的含量，批號161002的栓劑中對乙酰氨基酚的含量分別為100.3%，100.5%和100.4%；批號170204的栓劑中對乙酰氨基酚的含量分別為99.4%，99.7%和99.7%；批號170509的栓劑中對乙酰氨基酚的含量分別為100.1%，100.3%和99.9%。結(jié)果3個(gè)批號對乙酰氨基酚栓中對乙酰氨基酚標(biāo)示量的百分含量分別為100.4%，99.6%和100.1% (n=3)。結(jié)果表明，該廠所生產(chǎn)的對乙酰氨基酚栓含量符合要求。

表1對乙酰氨基酚栓劑的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test of Paracetamol Suppositories(n=6)

樣品含量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1.500 30.564 02.103 9101.999.22.01.499 90.564 02.021 097.9 1.500 20.564 02.049 599.3 1.500 10.564 02.041 698.9 1.499 70.564 02.081 2100.91.500 30.564 01.991 496.5

3 討論

3.1檢測方法的建立 目前對于對乙酰氨基酚成分的分析多見紫外分光光度法和HPLC法測定報(bào)道[16-19]。與文獻(xiàn)相比，本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS分析方法簡單可靠、重復(fù)性和分離效果好，可在短時(shí)間內(nèi)快速檢測出對乙酰氨基酚栓中對乙酰氨基酚的含量，可為該藥的質(zhì)量控制及藥品安全提供科學(xué)依據(jù)，并為對乙酰氨基酚的藥代動力學(xué)等相關(guān)研究提供可靠的含量測定方法。

3.2UPLC-MS/MS條件的確定 實(shí)驗(yàn)中比較了不同規(guī)格超高效液相色譜柱對色譜分離的影響，結(jié)果采用ACQUITYTMUPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)所得色譜峰保留時(shí)間適中，峰形較好。在實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)對流動相進(jìn)行了考察，分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨、甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨(含2 mL·L-1乙酸)和乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨，結(jié)果表明，甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨(含2 mL·L-1乙酸)(65∶35)作為流動相時(shí)，對乙酰氨基酚顯示較高的檢測靈敏度和較好的峰形。實(shí)驗(yàn)中還對離子檢測模式進(jìn)行了考察，對對乙酰氨基酚分別進(jìn)行了正、負(fù)離子掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對乙酰氨基酚在正離子模式下響應(yīng)較好，相應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)通過IntelliStart功能自動掃描確定，所得參數(shù)能較好地應(yīng)用于對乙酰氨基酚的含量測定。

4 小結(jié)

UPLC-MS/MS法檢測快速，極大地縮短了樣品的保留時(shí)間，有利于保證樣品的穩(wěn)定性，同時(shí)節(jié)省了分析時(shí)間和節(jié)約配制流動相所需的有機(jī)試劑，有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，可提高工作效率。該方法精密度好、靈敏度高，有利于今后進(jìn)一步分析測定對乙酰氨基酚在血漿中的濃度和進(jìn)行體內(nèi)藥代動力學(xué)的研究。該方法具有高分離、高靈敏度、高選擇性以及提供豐富結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)良的性能和操作性，使用廣泛，近年來越來越多地應(yīng)用于藥物含量測定，有利于更好地控制藥品質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS法同時(shí)對3個(gè)批號對乙酰氨基酚栓中的有效成分對乙酰氨基酚的含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，各批次中對乙酰氨基酚的含量無明顯差異，該方法簡單、靈敏度高，為對乙酰氨基酚栓的質(zhì)量控制提供了有效的檢測手段。