HPLC法測(cè)定蘆丁和木犀草素的含量

李 鵬，王 鵬，王小賓，楊廣德

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061；2.咸陽(yáng)市公安刑警支隊(duì)藥劑科，咸陽(yáng) 712000)

木犀草素(luteolin)(見(jiàn)圖1A)是一種天然四羥基黃酮類(lèi)化合物，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及增敏抗癌藥物活性等抗腫瘤作用，還具有抗氧化、抗炎、保護(hù)神經(jīng)、抗病毒以及降血脂和膽固醇等作用，有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和良好的開(kāi)發(fā)前景[1-4]。目前，木犀草素的來(lái)源除了天然提取外[5-7]，還有全合成與半合成法獲取[4]。采用蘆丁(見(jiàn)圖1B)為原料，能合成高收率和高含量的木犀草素[8-14]，該工藝原料易得、工藝簡(jiǎn)單、成本低。由于合成反應(yīng)過(guò)程中，通常需要檢測(cè)反應(yīng)的進(jìn)度以及合成物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，參考有關(guān)文獻(xiàn)[15-20]，制定用HPLC法測(cè)定蘆丁和木犀草素的含量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 L-3000型高效液相色譜儀(北京普源精儀科技有限責(zé)任公司)；Germsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，西安武本生物科技有限公司)；CPA225D型十萬(wàn)分之一電子天平(沈陽(yáng)神宇龍騰天平有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；UV765型紫外分光光度計(jì)(上海儀分科學(xué)儀器有限公司)。

圖1木犀草素和蘆丁的結(jié)構(gòu)式

A.木犀草素;B.蘆丁。

Fig.1 Structural formula of rutin and luteolin

A.luteolin;B.rutin.

1.2試藥 對(duì)照品：蘆丁(批號(hào)10080-201409，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.9%)，木犀草素(批號(hào)10086-201503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.37%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純，美國(guó)(TEDIA)天地試劑公司)；水(重蒸水，實(shí)驗(yàn)室自制)；磷酸(分析純，廣州市錦旺化工有限公司)；乙醇(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司)；樣品，實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Germsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為1 mL·L-1磷酸，梯度洗脫：0～8 min：20%A，8～15 min：20%～40%A，15～24 min：40%A，24～25 min：40%～20%A，25～30 min：20%A；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫：30 ℃。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取蘆丁和木犀草素對(duì)照品40.84和14.73 mg，置于同一50 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。配制成蘆丁和木犀草素質(zhì)量濃度分別為750.64和289.80 mg·L-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2樣品溶液 分別精密稱(chēng)取同一批號(hào)的蘆丁合成木犀草素樣品16.83和17.95 mg，置于50 mL量瓶中，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇超聲溶解，冷卻至室溫，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別吸取2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、空白溶劑以及樣品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在此色譜條件下，蘆丁和木犀草素的分離良好，分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，且理論塔板數(shù)不低于4 000，空白溶液不干擾測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2HPLC圖

A.對(duì)照品；B.樣品；C.溶劑；1.蘆??；2.木犀草素。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.reference substance;B.sample;C.solvent;1.rutin;2.luteolin.

2.4線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液1，2，4，6和8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻。連同對(duì)照品溶液各吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，蘆丁和木犀草素的回歸方程分別為：y=15.145x-135.6，r=0.999 7和y=38.075x-45.44，r=0.999 9。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘆丁和木犀草素的質(zhì)量濃度分別為75.06～750.64 和28.98～289.80 μg·mL-1，與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，重復(fù)進(jìn)樣6次，蘆丁和木犀草素的RSD值分別為0.46%和1.02%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品平行制備6份供試品溶液，依照2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算供試品含量。結(jié)果表明，蘆丁和木犀草素的平均含量分別為21.68%和62.37%，RSD值分別為0.12%和 0.37%。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別放置0，2，4，8，12和24 h后，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。蘆丁和木犀草素的RSD值分別為1.14%和0.81%。

2.8加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的同一供試品(蘆丁和木犀草素含量分別為18.28%和 64.37%)9份，分別置于50 mL量瓶中，樣品中加入不同量的蘆丁和木犀草素對(duì)照品溶液，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄蘆丁和木犀草素所對(duì)應(yīng)的峰面積，計(jì)算回收率，蘆丁和木犀草素的平均回收率分別為99.26%和98.88%，RSD值均小于2.0%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery tests of rutin and luteolin

取樣量/g樣品含量/g蘆丁木犀草素對(duì)照品加入量/g蘆丁木犀草素測(cè)得量/g蘆丁木犀草素回收率/%蘆丁木犀草素平均回收率/%蘆丁木犀草素RSD/%蘆丁木犀草素0.237 70.043 50.153 00.065 10.029 00.108 20.181 299.4697.4299.2698.881.141.870.267 30.048 90.172 10.065 10.029 00.113 20.200 898.8299.160.254 90.046 60.164 10.065 10.029 00.110 30.192 697.9998.410.309 30.056 50.199 10.130 10.058 00.188 00.255 4101.0497.060.258 60.047 30.166 50.130 10.058 00.176 40.223 499.2698.210.284 70.052 00.183 30.130 10.058 00.183 20.242 1100.79101.470.306 20.056 00.197 10.225 20.086 90.277 60.280 998.4296.330.262 50.048 00.169 00.225 20.086 90.272 50.256 899.71101.040.280 00.051 20.180 20.225 20.086 90.271 50.267 997.85100.84

2.9樣品測(cè)定結(jié)果 分別精密吸取2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液和樣品溶液各10 μL，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法分別計(jì)算蘆丁和木犀草素的含量，結(jié)果蘆丁和木犀草素的平均含量分別為18.45%和64.21%。

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了以甲醇2 mL·L-1磷酸水溶液、乙腈-1 mL·L-1磷酸和甲醇-0.1 mL·L-1磷酸水溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，乙腈和甲醇做有機(jī)相均能達(dá)到分離效果，但考慮到乙腈分離效果較理想，所以最終采用乙腈-1 mL·L-1磷酸，梯度洗脫為流動(dòng)相，峰形最佳，此時(shí)所有組分的出峰時(shí)間均在 25 min 前，且分離度好。

3.2色譜柱的選擇 選用Germsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)和Diamensil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，分離效果良好，選用Germsil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，出峰時(shí)間早，故優(yōu)先選擇該色譜柱。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取2.2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按照紫外分光光度法[21]，在200～600 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，在360 nm處，蘆丁和木犀草素均有最大吸收，故選擇兩者的共同檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

3.4樣品溶解溶劑的選擇 分別稱(chēng)取相同質(zhì)量的供試品5份，分別選用相同體積的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇、乙醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇以及流動(dòng)相溶解樣品，觀(guān)察樣品的溶解情況，結(jié)果體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶解樣品的效果最好，樣液清澈透明；甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇以及流動(dòng)相對(duì)產(chǎn)品的溶解樣液不夠清澈，故選用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為樣品溶解的溶劑。