異鼠李素對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的干預(yù)作用

白 跳， 遲麗屹， 高宇勤， 胡小菁

(1西安市第九醫(yī)院老年病一科， 西安 710054； 2解放軍第四五一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 西安 710054；3西安市第九醫(yī)院心血管內(nèi)科， 西安 710054)

糖尿病與心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，這類心臟疾病不依賴于高血壓和潛在的冠心病，稱為糖尿病心肌病[1]。糖尿病性心肌病的特征在于功能和結(jié)構(gòu)性心臟變化，包括心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積聚[2]，其中心肌纖維化是糖尿病心肌病心臟變化最常見(jiàn)的機(jī)制[2-3]。慢性高血糖可增加炎癥相關(guān)細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的水平，從而參與心肌纖維化的發(fā)展[4]。雖然慢性高血糖在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，但是心肌纖維化的分子機(jī)制尚不清楚。

中藥提取物如葡萄制品中的多酚，最近因其對(duì)心肌的保護(hù)作用而引起相當(dāng)大的關(guān)注[5]。其中，異鼠李素(分子式：C16H12O7)是一種從中藥中分離出的黃酮苷元，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中可用于預(yù)防和治療多種疾病，已發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等保護(hù)作用[6]。據(jù)報(bào)道，異鼠李素可以保護(hù)大鼠心室肌細(xì)胞免受缺血和再灌注損傷[7]。在Ⅱ型糖尿病大鼠模型中，異鼠李素能夠抑制腎臟氧化應(yīng)激并減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生[8]。同時(shí)已有文獻(xiàn)報(bào)道，異鼠李素可通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路減輕肝臟纖維化和氧化應(yīng)激[9]。因此，本研究擬探討異鼠李素對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化和TGF-β/Smad信號(hào)通路的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與藥物雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量約為170～210 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,異鼠李素由美國(guó)Sigma公司提供。

1.2主要試劑鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó)Sigma公司)，膠原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)和膠原蛋白Ⅲ(Collagen Ⅲ)抗體(美國(guó)Abcam公司)，β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和SMAD蛋白2/3(Smad 2/3)抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，馬森(Masson)三色染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司，丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)方案雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病組和異鼠李素組，每組10只。參照文獻(xiàn)[10]建立大鼠糖尿病模型。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組大鼠予以普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病組和異鼠李素組大鼠以高糖高脂飼料(含10%豬油、20%蔗糖，70%常規(guī)飼料)。喂養(yǎng)8 w后，糖尿病組和異鼠李素組大鼠腹腔單次注射溶于枸櫞酸鈉緩沖溶液鏈脲佐菌素(45 mg/kg)，對(duì)照組大鼠僅腹腔注入等量的枸櫞酸緩沖溶液。鏈脲佐菌素或單純枸櫞酸緩沖溶液腹腔注射后72 h于大鼠尾靜脈采血，采用Roche公司血糖檢測(cè)儀測(cè)量大鼠血糖濃度，判定大鼠空腹血糖濃度>11.6 mmol/L為糖尿病大鼠模型建立。此后，行4 w的藥物治療，異鼠李素組大鼠每日口飼生理鹽水溶解的異鼠李素(30 mg/kg)，糖尿病組和對(duì)照組每日口飼等體積生理鹽水。已有文獻(xiàn)報(bào)道異鼠李素(30 mg/kg)可有效抑制肝臟TGF-β/Smad信號(hào)通路從而減輕肝纖維化[9]，故參照該文獻(xiàn),本研究采用異鼠李素(30 mg/kg)治療4 w,以觀察異鼠李素對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的影響。

1.4血清生化指標(biāo)檢測(cè)藥物治療結(jié)束后，以戊巴比妥鈉(50 mg/kg)過(guò)量麻醉處死大鼠并行下腔靜脈取血，檢測(cè)空腹血糖濃度并收集血清，使用酶法測(cè)得血清甘油三酯和總膽固醇的含量。

1.5Masson染色各組取5只大鼠，麻醉后打開(kāi)胸腔,完整分離取出心臟，反復(fù)沖洗后將心臟組織置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，包埋為石蠟組織塊后切成厚度為5 μm的切片。參照Masson染色試制盒說(shuō)明書行心臟Masson三色染色，觀察心肌組織中膠原纖維的含量。Masson染色后以95%酒精和二甲苯行充分脫水透明，封片后于光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇5個(gè)鏡下低倍視野框(×100)，鏡下膠原纖維呈藍(lán)色，肌肉呈紅色。計(jì)算每個(gè)視野的心肌膠原纖維面積與心肌總面積比值，記為心肌纖維化面積比值。

1.6Westernblot蛋白分子檢測(cè)各組取5只大鼠，用于Western blot檢測(cè)和氧化應(yīng)激水平檢測(cè)。Western blot蛋白分子檢測(cè)時(shí)，稱取心肌組織約200 mg，剪碎后加入裂解液充分裂解，參考蛋白廠家說(shuō)明書操作步驟提取心肌組織總蛋白。采用BCA法測(cè)定各樣本蛋白總含量后，用等量蛋白樣本行聚丙烯酰胺凝膠電泳并電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并用5%脫脂牛奶封閉約30 min。用特定濃度一抗(抗Collagen Ⅰ抗體，1∶1 000；抗Collagen Ⅲ抗體，1∶750；抗TGF-β抗體，1∶1 000；抗Smad 2/3抗體，1∶1 000；抗β-actin抗體，1∶400)與PVDF膜4℃孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗室溫下孵育2 h，行ECL顯色。

1.7氧化應(yīng)激水平檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量反應(yīng)心肌氧化應(yīng)激水平。取心肌組織約100 mg，與10倍重量的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7.4)充分勻漿。收集的勻漿上清產(chǎn)物根據(jù)試劑盒廠家說(shuō)明書以分光光度計(jì)法測(cè)定SOD和MDA值。

2 結(jié)果

2.1異鼠李素對(duì)大鼠代謝及生化指標(biāo)的影響與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠體質(zhì)量減輕，但空腹血糖值和血清甘油三酯、總膽固醇含量明顯增加(P<0.05)。與糖尿病組比較，異鼠李素組大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加，空腹血糖值和血清甘油三酯、總膽固醇含量下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 異鼠李素對(duì)大鼠代謝及生化指標(biāo)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05； 與糖尿病組比較，△P<0.05。

2.2異鼠李素對(duì)心肌纖維化面積的影響與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠心肌纖維化面積比例明顯增加(P<0.05)，而糖尿病組、異鼠李素組大鼠心肌纖維化面積比例明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 異鼠李素對(duì)心肌纖維化面積的影響

注:n=5, 與對(duì)照組比較，*P<0.05; 與糖尿病組比較，△P<0.05。

對(duì)照組

糖尿病組

異鼠李素組

圖2對(duì)照組、糖尿病組、異鼠李素組的Masson染色病理結(jié)果

2.3異鼠李素對(duì)心肌CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，與糖尿病組比較，異鼠李素組大鼠心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)更低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4異鼠李素對(duì)心肌TGF-β和Smad2/3蛋白表達(dá)水平的影響與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠心肌TGF-β和Smad 2/3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，與糖尿病組比較，異鼠李素組大鼠心肌TGF-β和Smad 2/3蛋白表達(dá)水平較低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖3 異鼠李素對(duì)心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的影響

a： 心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖(n=5, 與對(duì)照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，△P<0.05)； b： 對(duì)照組、糖尿病組、異鼠李素組的Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)結(jié)果Western blot圖。

圖4 異鼠李素對(duì)心肌TGF-β和Smad 2/3蛋白表達(dá)水平的影響

a：心肌TGF-β和Smad 2/3蛋白表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖(n=5, 與對(duì)照組比較，*P<0.05；與糖尿病組比較，△P<0.05)；b：對(duì)照組、糖尿病組、異鼠李素組的TGF-β和Smad 2/3蛋白表達(dá)結(jié)果Western blot圖。

2.5異鼠李素對(duì)大鼠心肌氧化應(yīng)激水平的影響與對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠心肌MDA含量增加(P<0.05)，而SOD活性減少(P<0.05)，與糖尿病組比較，異鼠李素組大鼠心肌MDA含量減少(P<0.05)，而SOD活性增加(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 異鼠李素對(duì)大鼠心肌氧化應(yīng)激水平的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05； 與糖尿病組比較，△P<0.05。

3 討論

糖尿病心肌病最重要的病理特征是高血糖誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)(主要是Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ)過(guò)量產(chǎn)生，從而改變心臟的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致心臟順應(yīng)性下降和心臟的收縮及舒張功能減退[11]。本研究采用高脂高糖飲食誘發(fā)胰島素抵抗并單次注射鏈脲佐菌素(STZ)導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞的部分功能失調(diào)的方法構(gòu)建糖尿病心肌病大鼠動(dòng)物模型[12]。該方法處理后大鼠出現(xiàn)了明顯的高糖血癥和高膽固醇血癥，心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)增加，同時(shí)心肌Masson膠原染色發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠心肌組織中出現(xiàn)膠原堆積，提示糖尿病大鼠心肌纖維化。

異鼠李素是一種從野生植物醋柳果實(shí)中提取出的黃酮苷元[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路減輕肝臟纖維化[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可減少糖尿病組大鼠心肌Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)，而心肌Masson染色發(fā)現(xiàn)異鼠李素組大鼠心肌纖維化面積明顯減少，說(shuō)明異鼠李素可有效地緩解糖尿病大鼠的心肌纖維化。研究證實(shí)TGF-β/Smad信號(hào)通路與糖尿病心肌病中心肌纖維化的關(guān)鍵信號(hào)通路[13]。心肌TGF-β可在過(guò)量血糖影響下產(chǎn)生增多，促使心肌組織間質(zhì)中成纖維細(xì)胞激活，導(dǎo)致心肌纖維蛋白和膠原的合成。本研究結(jié)果顯示，異鼠李素組大鼠心肌TGF-β和Smad 2/3的蛋白表達(dá)水平較糖尿病組大鼠明顯降低，提示異鼠李素的抗心肌纖維化作用可能和其抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)。

研究表明，糖尿病所導(dǎo)致的心肌纖維化與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[1, 14]。高血糖可使機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧物，從而導(dǎo)致正常心肌細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷，并通過(guò)TGF-β等信號(hào)通路誘發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量生成[15]。本研究檢測(cè)了心肌氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)記物SOD和MDA的含量，結(jié)果顯示糖尿病大鼠心肌抗氧化應(yīng)激物質(zhì)SOD活性下調(diào)而脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA釋放量明顯上調(diào)。大量研究表明，異鼠李素具有明顯的抗氧化應(yīng)激作用。本研究結(jié)果表明，異鼠李素可明顯增加心肌SOD活性并減少M(fèi)DA含量，提示異鼠李素對(duì)糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用可能與其抗氧化應(yīng)激效果有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)制備大鼠糖尿病心肌病模型，探討異鼠李素對(duì)糖尿病大鼠心肌纖維化的影響，結(jié)果表明異鼠李素可緩解糖尿病大鼠心肌膠原蛋白聚集和纖維化進(jìn)程，其可能與其抗氧化應(yīng)激作用和抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)。