響應(yīng)面法優(yōu)化忍冬器官中四種成分的超聲提取工藝

胡玉濤　李天雪　許天罡

摘要：采用響應(yīng)面法優(yōu)化鹽堿地栽培忍冬（Lonicera japonica Thunb.）器官綜合物中咖啡酸、綠原酸、木犀草苷、多糖4種成分同時(shí)超聲提取的最佳條件。以咖啡酸、綠原酸、木犀草苷、多糖4種成分總含量為響應(yīng)值，通過Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)提取時(shí)間、溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)這4個(gè)主要因素進(jìn)行考察。結(jié)果表明，最優(yōu)提取條件為提取時(shí)間1 h，溫度75 ℃，料液比1∶40（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%。應(yīng)用超聲提取技術(shù)能夠在鹽堿地栽培的忍冬器官綜合物中同時(shí)獲得一定含量的綠原酸、多糖、咖啡酸、木犀草苷等產(chǎn)物，具有提取效率高、節(jié)約資源等優(yōu)勢(shì)。

關(guān)鍵詞：忍冬（Lonicera japonica Thunb.）；響應(yīng)面；咖啡酸；綠原酸；木犀草苷；多糖；超聲提取

中圖分類號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）09-0088-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.09.021

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Four Components from

Lonicera japonica Thunb. by Response Surface Method

HU Yu-tao1，LI Tian-xue1，XU Tian-gang2

（1.The Center for Drug Research & Development，Lianyungang College of Traditional Chinese Medicine of Jiangsu Province，Lianyungang 222007，Jiangsu，China；2.Zibo Wellcell Biotechnology Co.， Ltd.，Zibo 256302，Shandong，China）

Abstract： An ultrasonic-assisted extraction method was established to simultaneously produce the chlorogenic acid，cafferic acid，luteoloside and polysaccharose from Lonicera japonica Thunb. in saline-alkali land. Using the total concentration chlorogenic acid，cafferic acid，luteoloside and polysaccharose of as response value，Box-Behnken response surface design was adopted to investigate the four main factors of extraction time，temperature，solid/liquid ratio and ethanol concentration. The results showed that the optimization conditions for extraction were extraction time 1 h，temperature 75 ℃，and solid/liquid ratio 1∶40（g∶mL） and ethanol concentration 45%. The ultrasonic-assisted extraction of the four components has the advantage of accelerating the extraction process and better products with lower cost.

Key words： Lonicera japonica Thunb.；response surface method；chlorogenic acid；cafferic acid；luteoloside；polysaccharose；ultrasonic-assisted extraction

忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的花蕾入藥，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱、抗病毒、保肝利膽的作用[1，2]。莖藤入藥，具有清熱解毒、通絡(luò)的作用。忍冬的花及其莖、葉等器官富含揮發(fā)油、有機(jī)酸、黃酮、三萜、多糖等多種活性成分[3，4]。忍冬器官中的綠原酸、咖啡酸、多糖、木犀草苷等成分具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗輻射、延緩衰老及抗感染等多種作用[5]。忍冬作為藥食同源植物，在醫(yī)藥、食品、動(dòng)物養(yǎng)殖等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化[6]，分析了提取時(shí)間、溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)4種變量因素對(duì)鹽堿地栽培忍冬器官綜合物中咖啡酸、綠原酸、木犀草苷和多糖總量的影響，以期獲取最優(yōu)的提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：忍冬器官綜合物，為2017年5月下旬采自連云港市青口金銀花種植基地，土壤pH為8.16，含鹽量為0.33%，單位器官綜合物中花、莖、葉的平均含量分別為5.4%、41.4%和53.2%。

試劑：綠原酸、咖啡酸、木犀草苷均由南京澤朗生物科技有限公司提供，2種對(duì)照品經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98%以上；甲醇、乙腈為色譜純（Merk公司）；去離子水經(jīng)過Milli-Q系統(tǒng)純化制備；其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

儀器：1290HPLC型高效液相色譜儀（安捷倫公司），配有四元低壓梯度泵；AB135-S型十萬分之一電子分析天平（Mettler Toledo公司）；UV-1800型紫外-可見光分光光度計(jì)（日本島津制作所）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備 精密稱取對(duì)照品各10 mg，單獨(dú)以甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取適量?jī)?chǔ)備液混合置于容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，制得系列混合對(duì)照品溶液：1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、100.0、500.0 μg/mL綠原酸，0.2、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL咖啡酸，0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、20.00、50.00 μg/mL木犀草苷，避光保存。

1.2.2 色譜條件及方法學(xué)考察 色譜柱為Zorbox SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.2%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～6 min，10%乙腈；6～15 min，10%～30%乙腈；15～30 min，30%～60%乙腈；30～40 min，60%～100%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。以忍冬提取物濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.3 多糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定忍冬提取物中總糖含量[7，8]。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL）0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL依次加去離子水補(bǔ)至2 mL，另取去離子水2 mL作空白試驗(yàn)。每支試管加6%苯酚溶液1 mL，搖勻，然后每支試管中緩慢加入濃硫酸5 mL，搖勻并放入冷水中冷卻。在490 nm下比色測(cè)定，以葡萄糖質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程為A=0.126 3C+0.008，R2=0.996 1。

1.2.4 工藝流程 采摘的忍冬器官綜合物自然干燥后，粉碎過篩，精密稱取20 g，超聲提取兩次，兩次提取液合并后離心得到上清液。一份上清液測(cè)定咖啡酸、綠原酸和木犀草苷含量；另一份上清液加入無水乙醇使最終醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%后于常溫沉淀2.5 h，沉淀干燥后得到忍冬粗多糖，將上述干燥的粗多糖緩慢用去離子水溶解，并將此多糖溶液通過已活化的D101大孔樹脂柱去除小極性雜質(zhì)，流速8 mL/min，洗脫使用3倍柱體積的去離子水，流速10 mL/min，將此多糖洗脫溶液冷凍干燥后于4 ℃保存待用。

1.3 Box-Behnken響應(yīng)面法

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇顯著影響咖啡酸、綠原酸、木犀草苷和多糖總含量的4個(gè)因素，即提取時(shí)間（X1，min），溫度（X2，℃），料液比（X3）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4，%），以產(chǎn)物咖啡酸、綠原酸、木犀草苷和多糖總含量（Y，%）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，其他操作條件同“1.2.4”，共設(shè)計(jì)29組試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 忍冬3種化合物色譜分析

以化合物濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸分析，分別得到綠原酸、咖啡酸和木犀草苷回歸方程為y=8 604x-27 048（r=0.999 5）、y=3 349.5x-18 397（r=0.999 6）和y=57 785x-2 044（r=0.999 6），表明各化合物在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按照方法學(xué)相關(guān)要求進(jìn)行操作，結(jié)果表明，專屬性中供試品3種待測(cè)成分色譜峰的分離度均大于1.5，其他雜質(zhì)峰及空白對(duì)照溶液對(duì)待測(cè)成分均無干擾，方法專屬性良好（圖1）。在重復(fù)性試驗(yàn)中（n=6），綠原酸、咖啡酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為2.2%、1.7%和1.3%，在穩(wěn)定性試驗(yàn)中（n=6）3種化合物峰面積RSD均小于1.4%，在精密度試驗(yàn)中（n=6），3種化合物峰面積RSD均小于0.9%，表明重復(fù)性、穩(wěn)定性和精密度均良好；加樣回收率為98.2%～103.7%（RSD=2.4，n=5），表明準(zhǔn)確度較好。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。利用Design Expert 7.1.3軟件對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合并對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，模型方程的F值是16.33，且P=0.000 1<0.01，說明模型方程極顯著，該試驗(yàn)方法可靠。模型方程失擬項(xiàng)的P=0.116 8>0.05，為不顯著，表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。試驗(yàn)值與模型方程預(yù)測(cè)值的校正決定系數(shù)為0.961 6，表明該模型能解釋96.16%響應(yīng)值隨響應(yīng)因素的變化，模型擬合程度較好。對(duì)方程中各項(xiàng)進(jìn)行顯著性分析，一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互作用項(xiàng)的P均小于0.05，說明這4個(gè)因素以及因素之間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響都是顯著的，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)和4個(gè)有效成分的總產(chǎn)量的相互作用極顯著（P<0.000 1）。因此，所得模型方程能夠很好地預(yù)測(cè)產(chǎn)物總量隨各響應(yīng)因素的變化。

通過軟件繪制出能夠反映影響產(chǎn)物總量的4 個(gè)因素交互作用的三維響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，若等高線圖呈橢圓形則表明兩個(gè)因素交互作用顯著，若呈圓形則表明交互作用不顯著[9-11]。乙醇體積分?jǐn)?shù)X4和另外3個(gè)因素呈橢圓形的等高線圖，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)的作用顯著。

利用軟件中的優(yōu)化模塊得到最優(yōu)組合，即提取時(shí)間為1 h，溫度為75 ℃，料液比1∶40（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%。相應(yīng)總產(chǎn)量的模型預(yù)測(cè)值為13.05%。在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，操作同“1.2.4”項(xiàng)下，測(cè)得提取物中咖啡酸、綠原酸、木犀草苷和多糖總含量為12.98%（RSD=2.06%，n=3），其中咖啡酸含量0.91%、綠原酸含量5.0%、木犀草苷含量0.05%、多糖含量7.02%，表明響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到的工藝條件是有效、可行的。

3 討論

應(yīng)用超聲技術(shù)同時(shí)提取忍冬器官綜合物中多種成分，具有提取效率高、節(jié)約資源等優(yōu)勢(shì)，合適的水醇比是其關(guān)鍵因素。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸升高，產(chǎn)物的總量呈先增加后降低的趨勢(shì)。綠原酸、咖啡酸和木犀草苷在乙醇中的溶解度強(qiáng)于在純水中，乙醇體積分?jǐn)?shù)上升使得3種化合物的提取率上升，而金銀花多糖溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，乙醇體積分?jǐn)?shù)太高，則會(huì)導(dǎo)致多糖沉淀。經(jīng)優(yōu)化應(yīng)用45%的乙醇提取，綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和多糖的綜合提取率最佳。在含量檢測(cè)過程中以甲醇為系統(tǒng)各成分的分離效果并不理想，乙腈的黏度小，洗脫力大，經(jīng)優(yōu)化后的乙腈-甲酸水系統(tǒng)各成分的分離效果較好。應(yīng)用超聲提取技術(shù)能夠在鹽堿地栽培的忍冬器官綜合物中同時(shí)獲得一定含量的咖啡酸、綠原酸、木犀草苷、多糖等產(chǎn)物，而以器官綜合物為收獲目標(biāo)則更易于實(shí)施機(jī)械化采收，這將為實(shí)現(xiàn)忍冬的工廠化生產(chǎn)及其天然產(chǎn)物的深度開發(fā)提供參考。

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