4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶對(duì)糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平的影響

(山西職工醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030012)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，高血糖的原因包括胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，糖尿病存在的高血糖會(huì)導(dǎo)致器官組織損傷，功能受損[1]。近年來(lái)我國(guó)糖尿病的患病率呈直線上升趨勢(shì)，患病人數(shù)已達(dá)4 000萬(wàn)，其中糖尿病腎病的患病率為33.3%。所以糖尿病患者最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥和最終致死原因即糖尿病腎病，它嚴(yán)重威脅著患者的生活質(zhì)量和生命安全。目前，我國(guó)的糖尿病已上升為僅次于慢性腎炎所引起終末期腎臟疾病的第二大原因[1]。因此, 糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制和防治方法成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)非常重要的研究方向。研究資料表明糖尿病所產(chǎn)生的血管并發(fā)癥無(wú)論大血管，還是微血管，其發(fā)病機(jī)制均相同，即高糖損傷的共同基礎(chǔ)--氧化應(yīng)激[2]。新型抗氧化劑4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶(tempol)是超氧化物歧化酶的相似物，有歧化超氧陰離子的效果，但是其否可以對(duì)抗糖尿病腎病的氧化應(yīng)激過(guò)程，作為其治療藥物使用，則尚未見(jiàn)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，且其抗氧化機(jī)制目前也并不十分清楚。本研究先使用部分大鼠制造糖尿病模型，再用Tempol干預(yù)，最后檢測(cè)大鼠腎臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)，來(lái)闡明Tempol的抗氧化效果，為糖尿病腎病的防治提供新的思路和方法，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí))，體重(250±25)g。

1.1.2 主要試劑儀器 4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶(美國(guó)Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px) 、過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA) 試劑盒(南京建成生物工程研究所)、尿白蛋白試劑盒(法國(guó)SPI公司)；鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)；UV-752型紫外分光光度儀(上海精密儀器儀表有限公司)；三諾血糖儀(長(zhǎng)沙三諾生物傳感股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作及分組 由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心取回18只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病組和治療組，每組6只。

糖尿病大鼠模型的制備[3]：經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在造模前先給予大鼠高糖、高鹽、高脂飲食飼養(yǎng)2周左右，造模成功率較高。糖尿病組與治療組大鼠造模時(shí)腹腔注射劑量為30mg/kg的鏈脲佐菌素溶液(濃度：20 g/L), 72 h后由尾靜脈采血，檢測(cè)血糖。成模標(biāo)準(zhǔn)：大鼠空腹血糖≥16.7 mmol /L。對(duì)照組同時(shí)腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。待糖尿病模型大鼠血糖穩(wěn)定1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)， 治療組大鼠每天用Tempol溶于生理鹽水(濃度：10 mg/mL)中按60 mg/kg灌胃，對(duì)照組和糖尿病組大鼠每天灌胃等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間供給常規(guī)飼料，3組大鼠自主飲食，禁用激素、格列本脲、水果等對(duì)血糖有影響的藥物或食物。每周定時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠的體重、血糖(BG)和活動(dòng)情況。

1.2.2 標(biāo)本檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)4周后用代謝籠收集每只實(shí)驗(yàn)大鼠的24 h尿量并留存，嚴(yán)格按照法國(guó)SPI公司試劑盒說(shuō)明檢測(cè)24 h 尿白蛋白 (UAlb/24 h) 含量；再禁食12 h后稱(chēng)重記錄，用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血測(cè)血糖并記錄，然后放血處死大鼠并迅速取出右腎稱(chēng)重，計(jì)算大鼠腎重/體重(KW/BW)比值，分離腎皮質(zhì)，-70℃保存。拿出保存的右腎皮質(zhì)，加適量冰冷生理鹽水，在低溫下剪碎研磨制成組織勻漿，低溫離心3 min(3 000 r/min)后取上清液，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定MDA的含量，SOD、GSH-Px 和CAT 的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠KW/BW、 UAlb/24h和BG比較

實(shí)驗(yàn)4周后, 與對(duì)照組大鼠比較，糖尿病組和治療組的KW/BW、UAlb/24 h和BG均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組大鼠各指標(biāo)均較糖尿病組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠KW/BW、UAlb/24h和BG的比較

注：1)與對(duì)照組相比，P<0.05；2)與糖尿病組相比，P<0.05

2.2 各組大鼠腎組織MDA、SOD、GSH-Px和CAT水平比較

實(shí)驗(yàn)4周后, 與對(duì)照組比較，糖尿病組和治療組大鼠腎組織SOD活性減弱，GSH-Px活性增強(qiáng)，MDA含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CAT活性變化不大，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與糖尿病組比較，治療組大鼠腎組織CAT活性和MDA含量降低, SOD和GSH-Px活性增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎組織SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量比較

注：1)與對(duì)照組相比，P<0.05；2)與糖尿病組相比，P<0.05

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)糖尿病腎病的研究已經(jīng)越來(lái)越多，并且逐漸加深，已經(jīng)深入到分子水平。雖然截止目前其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，但對(duì)氧化應(yīng)激在糖尿病患者腎臟的病變過(guò)程中起著非常重要的作用，這一點(diǎn)已達(dá)成共識(shí)[1]。氧化應(yīng)激對(duì)糖尿病時(shí)腎組織的損害涉及多個(gè)方面，其中最重要的關(guān)鍵因子是活性氧自由基(reactive oxygenspecies, ROS)，由高糖引發(fā)腎小球系膜細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，激活蛋白激酶C，分裂原激活的蛋白激酶使轉(zhuǎn)錄因子核因子及活化蛋白-1，誘發(fā)多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的合成，這些因子激發(fā)多系列的生物化學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)腎細(xì)胞重構(gòu)，膠原蛋白合成增加，分解減少，引起腎臟增生，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生及病情進(jìn)展[4]。本研究中的Tempol是一種新型抗氧化劑，是ROS的清除劑，SOD的擬似物。與同類(lèi)抗氧化劑如硫酸鋅等比較，具有穩(wěn)定性高、穿透力強(qiáng)、分布廣，金屬非依賴(lài)性及毒性小等優(yōu)點(diǎn)。有抗ROS的作用，可清除O2-，減少OH-產(chǎn)生。

表1結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)4周后，與對(duì)照組、糖尿病組大鼠比較，治療組KW/BW、 UAlb/24 h、BG等3項(xiàng)指標(biāo)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Tempol能在一些方面保護(hù)早期糖尿病大鼠腎臟，可以減輕腎組織的水腫和增生重構(gòu)，減少尿蛋白含量，但不能改善到未發(fā)生糖尿病前。與糖尿病大鼠比較，治療組BG略低，但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與其他研究抗氧化劑對(duì)糖尿病大鼠的血糖無(wú)明顯改變不符[5]。按作用機(jī)制來(lái)說(shuō)Tempol并無(wú)降低糖的作用，產(chǎn)生不符的原因可能是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同，本研究時(shí)間較短，高糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激對(duì)大鼠的損傷是一個(gè)緩慢的漸變過(guò)程，損傷還未完全出現(xiàn)，Tempol的抗氧化作用在一定程度保護(hù)了早期糖尿病大鼠的胰島功能，延緩了胰島的病變過(guò)程，如延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，可能結(jié)果會(huì)發(fā)生改變。表2結(jié)果顯示：治療組大鼠經(jīng)Tempol治療后，腎組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的變化，與對(duì)照組、糖尿病組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明Tempol雖可使糖尿病大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平減輕，但不能完全阻斷氧化應(yīng)激發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程。糖尿病和治療組大鼠GSH-Px活性升高，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，按理論來(lái)說(shuō)，在氧化反應(yīng)中糖尿病大鼠GSH-Px活性應(yīng)不高于正常大鼠，原因可能是由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)產(chǎn)生的誤差，本研究時(shí)間較短，大鼠對(duì)突然出現(xiàn)的高糖刺激在短期內(nèi)產(chǎn)生了代償機(jī)制。另治療組CAT活性有所減弱，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，理論上來(lái)說(shuō)在氧化反應(yīng)中糖尿病大鼠CAT活性應(yīng)不低于正常大鼠，此結(jié)果產(chǎn)生的原因不明，可能屬實(shí)驗(yàn)操作誤差，由于無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，數(shù)據(jù)依然有效。

綜上所述，Tempol能在一定程度上抑制糖尿病大鼠腎組織中發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕糖尿病高糖情況下對(duì)腎臟的損傷過(guò)程，延緩糖尿病腎病的發(fā)展。但不能完全阻斷氧化應(yīng)激反應(yīng)，說(shuō)明氧化應(yīng)激是非常復(fù)雜的多系統(tǒng)多途徑反應(yīng)，Tempol只能阻滯其中的某些環(huán)節(jié)。