5種藥食同源植物的抗氧化作用

王朋朋, 徐 佳, 張麗梅, 張淑華, 王麗萍,

(1. 長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130022; 2. 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012；3. 新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)(集團(tuán))有限公司, 北京 102206)

藥食同源[1]植物指既可食用又可藥用的植物. 刺梨(Rosaroxburghii)、干姜(Zingiberoj-jicinaleRosc.)、肉桂(CinnamomumcassiaPresl)、山藥(Dioscoreaerhizoma)和葡萄籽(grape seed)均為藥食同源植物. 刺梨鮮果含鈣、鐵、碘、鋅和硒等多種微量元素及與豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 并含有多超氧化物歧化酶(SOD)和總黃酮[2]等活性成分, 具有抗輻射、消炎、抗癌等功效. 干姜主要含有姜辣素類、揮發(fā)油類、二苯基庚烷類等化學(xué)活性成分及少量的糖苷類、黃酮類、氨基酸、多種維生素等[3], 具有抑菌消炎、降脂降糖[4-5]、抗腫瘤[6]等功效. 肉桂主要含有肉桂精油、黃酮類、油樹脂、多糖、多酚等生理活性物質(zhì)[7], 具有消炎、降糖、抗腫瘤[8]等功效. 山藥含有蛋白質(zhì)、3,4-二羥基苯乙胺、維生素、植酸、膽堿、多巴胺、山藥堿等有效成分, 具有抗衰老、降糖降脂、抑腫瘤等功效[9]. 葡萄籽是葡萄的種子, 含有豐富的氨基酸、維生素、多酚類及礦物質(zhì)[10], 具有抗衰老、抗氧化[11]、抗腫瘤[12]等功效. 本文以典型抗氧化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物----秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans, 線蟲)為模式生物, 以5種藥食同源植物刺梨、干姜、肉桂、山藥、葡萄籽為原料, 采用水提法獲得各自有效成分, 通過(guò)對(duì)受試C.elegans的壽命實(shí)驗(yàn)、體外氧化壓力實(shí)驗(yàn)及C.elegans體內(nèi)自由基的測(cè)定, 綜合評(píng)估5種藥食同源植物的抗氧化作用.

1 材料和方法

1.1 儀器材料與試劑

電子分析天平(sartorius BT25S型, 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)； 數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型, 上海比朗儀器有限公司)； 高壓滅菌鍋(MLS-3750型, 松下健康醫(yī)療器械(上海)有限公司)； 高速低溫離心機(jī)(Centrifuge 5810R型, 德國(guó)Eppendorf公司)； 鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070 MBE型, 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)； 超聲波細(xì)胞破碎儀(JY96-IIN型, 寧波新芝生物科技股份有限公司)； 凍干機(jī)(ALPHA 1-4 LD plus型, 德國(guó)CHRIST公司)； 生化培養(yǎng)箱(SPL-80型, 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)； 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD型, 江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司)； 體視顯微鏡(XTL-24型, 上海普丹光學(xué)儀器有限公司)； 熒光酶標(biāo)儀(FLX-800型, 美國(guó)BioTek有限公司)等.

野生型秀麗隱桿線蟲(Bristol N2)、缺陷型大腸桿菌(EscherichiacoliOP50)均購(gòu)于美國(guó)Caenorhabditis Genetics Center； 刺梨、干姜、肉桂、山藥和葡萄籽原材料均由北京新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)(集團(tuán))有限公司提供; 胰蛋白胨、酵母抽提物均購(gòu)于英國(guó)OXOID公司； 瓊脂粉、膽固醇購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司； 二氯熒光黃(DCF)購(gòu)于上海試劑二廠； 其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.2 方 法

1.2.1 水提物制備 分別稱取一定質(zhì)量的刺梨、干姜、肉桂、山藥和葡萄籽, 剪刀剪碎, 研磨成粉, 在60 ℃下烘干后, 分別稱取20 g粉末溶于200 mL雙蒸水中, 置于超聲細(xì)胞粉碎儀中, 于40 ℃, 100 Hz超聲40 min后， 轉(zhuǎn)置恒溫培養(yǎng)箱于37 ℃, 200 r/min恒溫震蕩48 h. 離心(4 ℃, 4 000 r/min , 8 min)后取上清液, 再次離心(4 ℃, 8 000 r/min， 30 min), 取其上清液； 于凍干機(jī)中凍干后備用.

使用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OP50大腸桿菌菌液分別稀釋5種水提物凍干粉, 至終質(zhì)量濃度分別為0.5,1,2 mg/mL, 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中現(xiàn)用現(xiàn)配； 不添加凍干粉的OP50大腸桿菌菌液作為對(duì)照.

1.2.2 線蟲的培養(yǎng) 線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基(NGM)： 每配制100 mL NGM培養(yǎng)基需稱取0.30 g NaCl, 1.70 g瓊脂, 0.25 g蛋白胨, 5 mg/mL膽固醇乙醇溶液100 μL, 經(jīng)高壓蒸汽滅菌后, 室溫冷卻至約55 ℃, 分別加入100 μL無(wú)菌的1 mol/L CaCl2、1 mol/L MgSO4及1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS Buffer, pH=7.0)2.5 mL. 用無(wú)菌操作方法, 鋪平板于一次性塑料平皿. 待培養(yǎng)基冷凝后, 在NGM固體培養(yǎng)基表面涂布OP50菌液(空白組)、植物水提物混合OP50菌液(實(shí)驗(yàn)組), 于20 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后備用.

1.2.3 線蟲壽命的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13], 分別挑取同期化處理后的L4期線蟲, 各移至涂有大腸桿菌OP50的NGM平板上進(jìn)行培養(yǎng), 產(chǎn)卵時(shí)開始計(jì)時(shí)為0 d, 每隔1 d將線蟲移至相同的新NGM平板上觀察, 統(tǒng)計(jì)線蟲死亡情況, 直到受試線蟲全部死亡為止(每組統(tǒng)計(jì)50只線蟲). 以對(duì)刺激完全沒(méi)有反應(yīng)即認(rèn)定線蟲死亡. 在統(tǒng)計(jì)線蟲死亡情況時(shí), 不統(tǒng)計(jì)丟失的線蟲和蟲袋數(shù)據(jù). 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 受試線蟲在生長(zhǎng)至L4期分別進(jìn)行給藥, 各組給藥的質(zhì)量濃度均為2 mg/mL.

1.2.4 線蟲體外氧化壓力測(cè)定實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取10只同期化的L4期線蟲轉(zhuǎn)移至各給藥組, 平板20 ℃培養(yǎng)3 d后, 轉(zhuǎn)移至含有10 mmol/L過(guò)氧化氫的NGM培養(yǎng)基平皿中, 錫紙密封避光, 20 ℃恒溫保存. 每小時(shí)觀察并統(tǒng)計(jì)線蟲的存活數(shù)量. 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次作為平行實(shí)驗(yàn).

1.2.5 線蟲體內(nèi)自由基測(cè)定實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[14], 采用二氯熒光黃(DCF)對(duì)受試線蟲體內(nèi)的活性氧自由基進(jìn)行測(cè)定. 隨機(jī)選取100只處于L4期的線蟲(均經(jīng)同期化處理)移至各給藥組, 平板20 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后, 分別轉(zhuǎn)移至含有10 mmol/L過(guò)氧化氫的NGM液體培養(yǎng)基平皿中, 錫紙密封避光, 于20 ℃恒溫處理1 h后, 將各組線蟲先后用清水和NGM培養(yǎng)基各浸泡2遍, 每遍10 min, 之后移至96孔板中. 每孔分別加入50 μL NGM液體培養(yǎng)基和50 μL DCF, 將96孔板用錫紙包好避光, 于20 ℃, 130 r/min振蕩培養(yǎng)1 h. 使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)各受試組線蟲體內(nèi)活性氧自由基含量, 激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm, 阻斷波長(zhǎng)為528 nm. 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次作為平行實(shí)驗(yàn).

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

線蟲壽命測(cè)定的數(shù)據(jù)采用Prism GraphPad5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 線蟲存活的生長(zhǎng)曲線采用Kaplan-Meier方法生成. 用Log-rank (Mantel-Cox) Test軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn). 當(dāng)P<0.05*時(shí)表示具有顯著性差異; 當(dāng)P<0.01**時(shí)表示具有非常顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲壽命的測(cè)定結(jié)果

對(duì)線蟲壽命進(jìn)行測(cè)定可直觀評(píng)價(jià)線蟲處于何種生理狀態(tài), 是對(duì)外界藥物進(jìn)行評(píng)估的重要參考指標(biāo)之一. 外界藥物可通過(guò)改變受試線蟲的代謝速率、抗熱激能力、抗氧化能力以及脂肪積累等調(diào)節(jié)線蟲壽命[15]. 用Log-rank (Mantel-Cox) Test進(jìn)行分析計(jì)算, 刺梨、葡萄籽、干姜、肉桂、山藥水提物對(duì)線蟲壽命的影響如圖1所示. 由圖1可見(jiàn), 與對(duì)照組相比, 2 mg/mL的刺梨和葡萄籽水提物能非常顯著延長(zhǎng)受試線蟲壽命(P<0.01), 干姜、肉桂和山藥水提物對(duì)受試線蟲壽命影響不明顯(P>0.05).

圖1 刺梨、葡萄籽水提物(A)和干姜、肉桂、山藥水提物(B)對(duì)線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of R.roxburghii, grape seeds water extractions (A) and Z.oj-jicinale, C.cassia, D.rhizoma water extractions (B) on lifespan of C.elegans

2.2 線蟲體外氧化壓力測(cè)定結(jié)果

體外氧化壓力實(shí)驗(yàn)可通過(guò)過(guò)氧化氫、百草枯等物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化壓力[16]. 本文采用10 mmol/L過(guò)氧化氫分別對(duì)各組受試線蟲進(jìn)行處理, 即通過(guò)外界氧化壓力的作用, 啟動(dòng)線蟲本身的應(yīng)激性抵抗反應(yīng)功能, 在一定程度上可提升線蟲的耐受能力, 但超過(guò)一定限度即導(dǎo)致氧化損傷. 采用5種植物提取物對(duì)線蟲進(jìn)行給藥保護(hù), 結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見(jiàn), 與對(duì)照組相比, 3種質(zhì)量濃度(0.5,1,2 mg/mL)的5種植物水提物對(duì)受試線蟲作用后, 均呈非常顯著性差異(P<0.01). 表明在10 mmol/L過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的體外氧化壓力下, 5種不同種類、不同質(zhì)量濃度的植物水提物均對(duì)受試線蟲具有很強(qiáng)的氧化損傷修復(fù)能力, 且總體呈劑量-效應(yīng)關(guān)系.

2.3 線蟲體內(nèi)自由基測(cè)定結(jié)果

自由基與生物氧化作用關(guān)系密切, 正常的生物機(jī)體需保持一定的自由基水平, 即生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除需維持一種動(dòng)態(tài)變化的平衡關(guān)系. 若外界環(huán)境或外源物質(zhì)對(duì)生物機(jī)體產(chǎn)生氧化壓力, 則生物體內(nèi)自由基的生成水平明顯提高, 打破平衡狀態(tài), 導(dǎo)致生物體的氧化應(yīng)激[17], 最終對(duì)生物體造成損害. DCF進(jìn)入受試線蟲體內(nèi)后會(huì)被酯酶水解, 去乙?；笮纬啥葻晒恻S雙乙酸(DCFH), DCFH可與細(xì)胞內(nèi)自由基作用, 生成有熒光的產(chǎn)物, 在480～520 nm條件下產(chǎn)生熒光, 熒光強(qiáng)度與自由基數(shù)量呈正相關(guān). 先用10 mmol/L過(guò)氧化氫分別對(duì)各組受試線蟲進(jìn)行處理后, 自由基水平均顯著增加, 再用5種植物提取物進(jìn)行給藥保護(hù), 結(jié)果如圖3所示.

圖2 刺梨、干姜、肉桂、山藥、葡萄籽水提物對(duì)氧化壓力下線蟲的保護(hù)作用Fig.2 Protective effects of R.roxburghii, Z.oj-jicinale, C.cassia, D.rhizoma, grape seeds water extractions on C.elegans under oxidative stress

圖3 刺梨、干姜、肉桂、山藥、葡萄籽水提物對(duì)受試線蟲體內(nèi)自由基的清除能力Fig.3 Free radical scavenging abilities of R.roxburghii, Z.oj-jicinale, C.cassia, D.rhizoma, grape seeds water extractions on tested C.elegans

由圖3可見(jiàn), 與對(duì)照組相比, 0.5,1,2 mg/mL的5種植物水提物均對(duì)受試線蟲體內(nèi)的自由基具有一定的清理能力, 且符合劑量-效應(yīng)關(guān)系. 其中1 mg/mL的刺梨水提物和1 mg/mL的葡萄籽水提物與對(duì)照組相比具有顯著差異； 2 mg/mL的刺梨水提物和2 mg/mL的葡萄籽水提物與對(duì)照組相比具有非常顯著差異. 表明刺梨和葡萄籽清除受試線蟲體內(nèi)自由基的效果較好， 其他3種植物水提物的效果一般.

綜上所述, 本文以秀麗隱桿線蟲為模式動(dòng)物, 通過(guò)壽命測(cè)定實(shí)驗(yàn)、體外氧化壓力測(cè)定實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)自由基測(cè)定實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)刺梨、干姜、肉桂、山藥、葡萄籽5種藥食同源植物的抗氧化效果. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 2 mg/mL的刺梨和葡萄籽水提物均能非常顯著延長(zhǎng)受試線蟲壽命； 5種不同質(zhì)量濃度植物的水提物均對(duì)受試線蟲具有顯著的氧化損傷修復(fù)能力和抗氧化能力； 不同質(zhì)量濃度的5種植物水提物均對(duì)受試線蟲具有一定的清除體內(nèi)自由基能力, 其中刺梨和葡萄籽清除自由基效果顯著.