Hedgehog和NF—κB信號(hào)通路在結(jié)核分枝桿菌感染Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中的免疫調(diào)控作用初探

杜軍 任奇杰 王媛 王娟 李勇

摘要：探討結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（Alveolar epithelial typeⅡcells，AECⅡ）的免疫應(yīng)答過(guò)程中，Hedgehog與NF-κB信號(hào)通路及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)變化規(guī)律。利用結(jié)核分枝桿菌BCG（Bacillus Calmette-Guérin，BCG，卡介苗，弱毒株）和H37Rv（國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株）株分別感染人AECⅡ細(xì)胞株A549，利用qPCR和Western blot檢測(cè)Hedgehog信號(hào)通路以及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)變化。結(jié)果表明，H37Rv和BCG感染A549細(xì)胞后，Hedgehog信號(hào)通路中Shh、Ptch和Gli1與NF-κB信號(hào)通路中p-NF-κB mRNA的表達(dá)水平升高，同時(shí)，伴隨著炎癥細(xì)胞因子IL-8和TNF-α mRNA的表達(dá)水平也升高。并且，H37Rv感染A549細(xì)胞引起信號(hào)分子Shh、Ptch、Gli1和NF-κB蛋白的表達(dá)水平高于BCG。Mtb感染AECⅡ細(xì)胞都能激活Hedgehog信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路并促進(jìn)細(xì)胞的炎癥因子分泌，強(qiáng)毒株感染對(duì)信號(hào)通路的活化強(qiáng)于弱毒株。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；肺泡上皮細(xì)胞；Hedgehog；NF-kappaB；炎癥因子

中圖分類(lèi)號(hào)：S855.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）11-0070-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.017

Abstract： In order to investigate the roles of expression of Hedgehog and NF-κB signaling pathway signal molecules and inflammatory cytokines in the alveolar epithelial typeⅡ cells （AECⅡ） infected with Mycobacterium tuberculosis（Mtb），the human AECⅡ cell line A549 was infected with Bacillus Calmette-Guérin（BCG，attenuated strain） and H37Rv （international standard virulent strain） respectively，and the signal molecules of Hedgehog and NF-κB signaling pathway and inflammatory cytokines in A549 cells of immune response to Mtb was detected by qPCR，and Western blot. The results showed that， the expression of Shh，Ptch and Gli1 in Hedgehog signaling pathway and the phosphorylation of NF-κB in NF-κB signaling pathway was increased in A549 cells when infected with H37Rv and BCG，and at the same time，the expression of IL-8 and TNF-α was also upregulated. And the protein expression of Shh，Ptch，Gli1 and NF-κB in A549 cells infected with H37Rv was higher than that infected with BCG. The Hedgehog and NF-κB signaling pathway could be activated， and the expression of inflammatory cytokines could be promoted in AECⅡ cells when infected with Mtb. The activation level of the both signaling pathway infected with Mtb virulent strain was higher than that of infected with BCG strain.

Key words：Mycobacterium tuberculosis；alveolar epithelial cells；Hedgehog；NF-kappaB；inflammatory cytokines

肺結(jié)核（Tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的慢性、消耗性人獸共患傳染病。2014年，全球死于結(jié)核病的人數(shù)為150萬(wàn)，新發(fā)病例近960萬(wàn)。全球54%的結(jié)核病例出現(xiàn)在中國(guó)、印度、印度尼西亞、尼日利亞與巴基斯坦等國(guó)，WHO估算中國(guó)2014年的新發(fā)肺結(jié)核人數(shù)為93萬(wàn)，位居全球第三位。由于人畜結(jié)核病的交叉感染以及多耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致結(jié)核病的防治難度增大，并且結(jié)核病的人獸疫情在世界部分國(guó)家和地區(qū)發(fā)病隱患日趨嚴(yán)重[1，2]。雖然從Mtb發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已有130多年的歷史，但是結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制與機(jī)體免疫調(diào)控機(jī)理尚未闡明[3]。

在過(guò)去20年中，分泌蛋白Shh（sonic hedgehog）被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育及氣道和肺泡隔室組織中上皮-間質(zhì)細(xì)胞相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[4]。近年來(lái)對(duì)于Shh信號(hào)通路在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方面的關(guān)注程度越來(lái)越高，其在機(jī)體免疫反應(yīng)中的作用也備受關(guān)注，越來(lái)越多的證據(jù)證明在許多成年個(gè)體的肺部疾病如肺纖維化、哮喘、肺癌及慢性肺部炎癥疾病中都有Shh信號(hào)的激活[5，6]。在Mtb感染細(xì)胞時(shí)Shh信號(hào)通路會(huì)被激活，但是對(duì)強(qiáng)弱毒株感染細(xì)胞時(shí)Shh信號(hào)通路的表達(dá)變化尚缺乏系統(tǒng)的研究。另一方面，NF-κB作為一類(lèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞對(duì)不同外界刺激做出合適的細(xì)胞信號(hào)應(yīng)答，這種調(diào)控作用依賴NF-κB與多種信號(hào)通路相互鏈接的上下游協(xié)同作用，NF-κB信號(hào)通路與Shh信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)[7]。為此，試驗(yàn)將基于以上研究結(jié)果，用Mtb感染AECⅡ細(xì)胞，分析Hedgehog和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子及炎性因子的表達(dá)變化，探究在AECⅡ細(xì)胞受到Mtb感染時(shí)Hedgehog和NF-κB信號(hào)通路及其在細(xì)胞的炎癥應(yīng)答過(guò)程中的變化規(guī)律，旨在為揭示結(jié)核病的發(fā)病機(jī)理和防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞 卡介苗（BCG），購(gòu)自成都生物制品研究所；結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株（H37Rv），由寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)室提供；人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試驗(yàn)試劑 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和SuperSignal West Pico Trial Kit（Thermo），Trizol（Invitrogen），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega），Real Time PCR試劑盒（Qiagen），考馬斯G-250和Tween-80（Sigma），Middlebrook 7H9（BD），6×Protein Loading Buffer（全式金），Acr-Bis 30%和Tris-HCl Buffer（上海百賽），改良羅氏培養(yǎng)基（青島海博），Western BrightTM ECL（Advansta），全面蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒（凱基），ELISA試劑盒（欣博盛），Shh（CST，CST#2207），p-NF-κB（CST，CST#3033），Ptch（Proteintech，17520-1-AP），Gli1（Proteintech，25733-1-AP），β-actin（中山金橋， TA-09），羊抗兔IgG-HRP（中山金橋，ZB-2301），山羊抗小鼠IgG-HRP（中山金橋，ZB-2305），Middlebrook OADC Enrichment（BD）等。

1.1.3 引物 試驗(yàn)所使用熒光定量PCR的引物按照熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，并在Invitrogen公司合成，詳見(jiàn)表1。

1.2 BCGD毒株和H37Rv的培養(yǎng)

挑取健康的BCG和H37Rv單菌落菌株接種于BD 7H9液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～4周后，可觀察到菌體生長(zhǎng)導(dǎo)致的培養(yǎng)基渾濁現(xiàn)象。

BD 7H9液體培養(yǎng)基配方為0.47 g BD 7H9+89.8 mL ddH2O+0.2 mL Tween-80，121 ℃ 高壓滅菌30 min，使用前加入10 mL Middlebrook OADC Enrichment，混勻、分裝。

1.3 BCG和H37Rv感染A549細(xì)胞

用胰酶消化A549細(xì)胞，用RPIM 1640完全培養(yǎng)基稀釋成2.5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，2 mL/孔接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)；當(dāng)A549細(xì)胞匯合率達(dá)到60%時(shí)換培養(yǎng)液，用1640完全培養(yǎng)液重懸BCG和H37Rv，以感染復(fù)數(shù)MOI（multiplicity of infection，細(xì)菌數(shù)與細(xì)胞數(shù)的比例）10∶1分別進(jìn)行感染，同時(shí)，設(shè)空白對(duì)照。

1.4 Realtime-qPCR檢測(cè)Hedgehog和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子及炎癥細(xì)胞因子在mRNA水平的表達(dá)變化

用BCG和H37Rv感染的A549細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄并利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Hedgehog和NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)分子和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)情況（表1）；按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)裂解細(xì)胞提取mRNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，用Nanodrop 1000（Thermo）紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度；參考Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR；參照天根公司的熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.5 Western Blot檢測(cè)Hedgehog和NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)因子在蛋白水平的變化

按照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)（凱基）提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量；進(jìn)行SDS-PAGE，每孔蛋白上樣量為20～30 μg，電壓80 V。將SDS-PAGE結(jié)果40 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜過(guò)夜；將PVDF膜放入雜交盒并加入封閉液15 mL，室溫，勻速搖床上緩慢搖動(dòng)封閉1 h；倒掉封閉液，加入稀釋好的一抗，4 ℃下在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一晚；次日用15 mL的TBST緩沖液洗膜，每次搖動(dòng)洗滌10 min，共洗3次；將二抗按1∶1 000（二抗：5%BSA溶液）的比例稀釋加入，室溫下?lián)u動(dòng)1～2 h后用15 mL的TBST緩沖液洗膜3次；用PBS漂洗2次，將配制的ECL顯色液滴加到PVDF膜上，室溫反應(yīng)5 min，用保鮮膜包裹并放入暗盒，曝光洗片。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用LSD檢驗(yàn)對(duì)各組進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞總mRNA的提取

對(duì)提取的細(xì)胞總mRNA進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果（圖1）表明，試驗(yàn)提取的mRNA 28S、18S、5.8S條帶完整，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)和RT-qPCR試驗(yàn)。

2.2 Mtb感染A549細(xì)胞Hedgehog和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子及炎癥細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)變化

當(dāng)BCG毒株感染A549細(xì)胞24 h時(shí)，促進(jìn)了Hedgehog信號(hào)通路中Shh、Gli1和Gli2的表達(dá)，抑制了Ptch和Smo的表達(dá)（圖2A），表明BCG感染促進(jìn)了Hedgehog信號(hào)通路的活化。在NF-κB信號(hào)通路中，BCG毒株感染抑制了TLR2、TLR4和NF-κB的表達(dá)而促進(jìn)了MyD88和炎癥細(xì)胞因子IL-8和TNF-α的表達(dá)，抑制了IL-6和IL-12A的表達(dá)（圖2B、圖2C），這可能是因?yàn)槿醵局闎CG感染引起較弱的炎癥反應(yīng)，且炎癥反應(yīng)不依賴于TLR2/TLR4的活化。

當(dāng)強(qiáng)毒株H37Rv感染A549細(xì)胞24 h時(shí)，促進(jìn)了Hedgehog信號(hào)通路中Gli1和Gli2的表達(dá)，同時(shí)也促進(jìn)了NF-κB信號(hào)通路中TLR2/TLR4的表達(dá)，并顯著促進(jìn)了炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)，對(duì)MyD88和IL-12A的表達(dá)有一定抑制作用（圖2A、圖2B、圖2C），表明H37Rv感染能激活Hedgehog信號(hào)通路并引起A549細(xì)胞較強(qiáng)的炎癥細(xì)胞因子分泌。結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，H37Rv毒株感染引起Shh的表達(dá)低于BCG毒株感染，而Ptch、Gli1、Gli2、TLR2/TLR4和NF-κB以及炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)都高于BCG感染組。這些結(jié)果表明，H37Rv和BCG毒株感染都能激活Hedgehog信號(hào)通路并促進(jìn)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并且H37Rv毒株感染引起的炎癥反應(yīng)強(qiáng)于BCG毒株感染。

2.3 Mtb感染A549細(xì)胞Hedgehog和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)變化

BCG感染A549細(xì)胞24 h時(shí)，促進(jìn)了Shh信號(hào)通路中Shh、Ptch和Gli1蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果與mRNA表達(dá)一致；p-NF-κB表達(dá)水平也升高，這與NF-κB mRNA的表達(dá)不一致，可能是BCG感染促進(jìn)了胞漿中NF-κB的活化（圖3A、圖3E）。H37Rv感染組A549細(xì)胞24 h時(shí)，促進(jìn)了Ptch、Gli1和p-NF-κB的表達(dá)，H37Rv感染A549細(xì)胞引起Gli1和p-NF-κB的表達(dá)水平都高于BCG感染組（圖3A、圖3B、圖3C、圖3D）。這些結(jié)果表明，BCG和H37Rv感染都促進(jìn)了Hedgehog信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路的活化，且H37Rv感染對(duì)Hedgehog信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路的活化程度高于BCG感染。

3 小結(jié)與討論

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)體受到外源微生物入侵時(shí)，Hedgehog信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路等通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞、AECⅡ細(xì)胞等具有免疫調(diào)控功能的細(xì)胞，在不同程度上參與了機(jī)體的炎性應(yīng)答[8，9]。當(dāng)機(jī)體的組織或細(xì)胞受到感染性因素或腫瘤性因素侵襲時(shí)，由于外界刺激及壓力脅迫會(huì)引起機(jī)體的免疫調(diào)控和炎性反應(yīng)，發(fā)育相關(guān)的Hedgehog信號(hào)通路此時(shí)也參與了機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)控和炎癥反應(yīng)[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，Mtb感染A549細(xì)胞可激活細(xì)胞內(nèi)Hedgehog信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞存活[13]。NF-κB是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其活化可激活下游眾多的細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，在機(jī)體對(duì)抗外源微生物侵染時(shí)調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在Mtb感染A549細(xì)胞后，能促進(jìn)Shh信號(hào)通路中Shh、Ptch和Gli1的表達(dá)，這表明Mtb感染機(jī)體能激活Hedgehog信號(hào)通路。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在Mtb感染AECⅡ細(xì)胞時(shí)，雖然NF-κB在mRNA水平表達(dá)下調(diào)，但是在蛋白質(zhì)水平p-NF-κB的表達(dá)水平顯著上調(diào)，這是因?yàn)镹F-κB是以活化形式，即磷酸化形式（p-NF-κB）在細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[15-17]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，H37Rv感染對(duì)Hedgehog信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路的激活作用弱于BCG感染。

IL-6可以誘導(dǎo)B細(xì)胞的分化，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)造血干細(xì)胞分化等[18]，TNF-α又叫腫瘤壞死因子，能促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎性因子并促進(jìn)炎癥應(yīng)答[19]。試驗(yàn)中，BCG毒株感染AECⅡ細(xì)胞促進(jìn)了IL-8的表達(dá)，而抑制IL-6和TNF-α的表達(dá)，這種促進(jìn)作用可以加強(qiáng)BCG毒株對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用[20]，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[21]。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，H37Rv感染AECⅡ細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)強(qiáng)于BCG感染，這進(jìn)而證實(shí)了Mtb強(qiáng)毒株感染可引起機(jī)體細(xì)胞較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和壞死，而弱毒株引起弱的炎癥反應(yīng)并通過(guò)免疫應(yīng)答保護(hù)機(jī)體抵抗Mtb感染[22-25]。同樣有研究表明，BCG和H37Rv感染肺泡上皮細(xì)胞后僅H37Rv毒株產(chǎn)生細(xì)胞毒性[26]。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究Mtb感染AECⅡ細(xì)胞時(shí)的免疫調(diào)控作用提供理論依據(jù)。

H37Rv和BCG毒株感染都能激活Hedgehog信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路，并且H37Rv感染對(duì)兩種信號(hào)通路的表達(dá)促進(jìn)作用弱于BCG毒株感染組。H37Rv感染組和BCG感染組都能促進(jìn)細(xì)胞的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，并且H37Rv毒株感染引起炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)作用強(qiáng)于BCG毒株感染組。

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