采用大孔吸附樹(shù)脂純化發(fā)酵液中D-3-苯基乳酸

鄭青云，程俊，崔春霞，朱益波

(常熟理工學(xué)院，江蘇 常熟，215500)

3-苯基乳酸是一種重要的前體化合物，廣泛用于醫(yī)藥、化工、生物合成等領(lǐng)域[1]。D-3-苯基乳酸(D-3-phenyl lactic acid，PLA)是3-苯基乳酸的一種光學(xué)異構(gòu)體。近年來(lái)，研究人員在一些天然蜂蜜、干酪、發(fā)酵面團(tuán)及乳酸菌、白地霉的發(fā)酵產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)該化合物的存在，并證明該化合物起到了抑制產(chǎn)品霉變、腐敗，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期的作用[2-7]。PLA對(duì)于常見(jiàn)致病菌以及真菌具有廣譜而高效的抑菌活性[2-3]，使其有望成為一種更為安全、高效的天然抑菌劑。由于化學(xué)法合成的3-苯基乳酸為外消旋混合物，需要復(fù)雜的拆分過(guò)程以獲得高光學(xué)純度產(chǎn)物[8-9]。因此，近年來(lái)，包括本研究室在內(nèi)的眾多研究者在PLA的高光學(xué)純度生物合成與轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行了廣泛而深入的研究[6, 10-33]。目前利用重組大腸桿菌合成PLA的生產(chǎn)強(qiáng)度已經(jīng)達(dá)到10 g/(L·h)以上，光學(xué)純度接近100%[31]。然而，PLA的提取純化方法目前依然主要是采用乙酸乙酯萃取法[34]。該方法需用酸將料液pH值調(diào)節(jié)至2，再加入萃取劑進(jìn)行萃取，有機(jī)相再經(jīng)減壓蒸餾獲得產(chǎn)品。該方法比較適用于化學(xué)合成法，對(duì)于利用微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝獲得的產(chǎn)品，因其成分相對(duì)復(fù)雜，使用簡(jiǎn)單的萃取法已不能滿足純化的要求，因此開(kāi)發(fā)適用于提取發(fā)酵液中的PLA工藝顯得尤為重要。

本研究使用離子交換法從發(fā)酵液中直接分離PLA,通過(guò)對(duì)常用陰離子交換樹(shù)脂的篩選，優(yōu)化了上樣和洗脫條件，建立了適用于重組大腸桿菌合成產(chǎn)物的離子交換樹(shù)脂分離純化PLA工藝，為用離子交換樹(shù)脂純化PLA及類似物提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑和菌株

D-3-苯基乳酸(PLA)和苯丙酮酸(PPA)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨等購(gòu)自O(shè)xoid；異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；離子交換樹(shù)脂：201×7、D101、D285、D301、D315、D318購(gòu)自艾美科健(中國(guó))生物醫(yī)藥有限公司。

1.1.2 菌株

菌株：E.colipET-28a-ldhY52V，實(shí)驗(yàn)室保藏[30]。

1.1.3 主要儀器

高效液相色譜儀LC-20A,日本島津公司；THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器,太倉(cāng)市華美生化儀器廠；BSZ-160F電腦自動(dòng)部分收集器,上海精科實(shí)驗(yàn)有限公司；HL-2恒流泵,上海佳鵬科技有限公司；超純水機(jī),蘇州賽恩斯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組大腸桿菌合成PLA

參考ZHU[30]的方法，將重組大腸桿菌E.colipET-28a-ldhY52V接種于LB培養(yǎng)基中(含50 mg/L 硫酸卡納霉素)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)添加IPTG至0.6 mmoL/L，25 ℃誘導(dǎo)4 h。將菌體于4 ℃，6 000 r/min離心10 min。菌泥用pH=7.0的磷酸緩沖溶液洗滌2次。收集的菌泥重懸于50 mL含7.5 g/L苯丙酮酸，10 g/L 葡萄糖的pH=7.0的磷酸緩沖溶液中，37 ℃，200 r/min轉(zhuǎn)化1 h。發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min收集上清液待用。

1.2.2 樹(shù)脂的預(yù)處理及選型

樹(shù)脂的預(yù)處理：用體積分?jǐn)?shù)5%的HCl浸泡24 h，再用蒸餾水洗至中性，然后用體積分?jǐn)?shù)5% NaOH浸泡24 h，再用蒸餾水洗至中性。

樹(shù)脂的選型：采用靜態(tài)試驗(yàn)篩選出吸附能力較強(qiáng)的樹(shù)脂。靜態(tài)試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取已處理好的樹(shù)脂1 g，分別放入盛有20 mL，20 g/L PLA的錐形瓶中，在恒溫振蕩器中，以30 ℃、200 r/min的條件振蕩交換24 h，定時(shí)取樣測(cè)定PLA質(zhì)量濃度，以減差法計(jì)算樹(shù)脂的平衡吸附量[35]。

1.2.3 固定床上樣條件優(yōu)化

玻璃層析柱，樹(shù)脂體積裝填量為4 mL。選用不同上樣流量(4、7、10、13 BV/h)和徑高比(1∶5、1∶7、1∶10、1∶15)將發(fā)酵液分別上樣。自動(dòng)部分收集器收集流出液，每管收集2 mL流出液，測(cè)定其PLA質(zhì)量濃度。

1.2.4 洗脫條件優(yōu)化

發(fā)酵液進(jìn)行上樣后用1倍柱床體積超純水洗去柱中殘留的發(fā)酵液。然后用不同濃度NaCl和HCl溶液進(jìn)行洗脫，洗脫劑流速為5 BV/h, 分別收集流出液，測(cè)定PLA和PPA質(zhì)量濃度。

1.2.5 定量分析

取樣品適當(dāng)稀釋，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后由高效液相檢測(cè)。色譜條件根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)定[30]：色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H有機(jī)酸分析柱；流動(dòng)相為5 mmol/L稀H2SO4；流速為0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，葡萄糖采用串聯(lián)示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組大腸桿菌合成PLA過(guò)程

采用E.colipET-28a-ldhY52V轉(zhuǎn)化PPA合成PLA的過(guò)程如圖1所示。分批轉(zhuǎn)化過(guò)程表明底物PPA在前30 min迅速轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物PLA，之后隨著底物濃度的下降，產(chǎn)物PLA合成速率也隨之降低，經(jīng)過(guò)60 min的轉(zhuǎn)化，最終PLA質(zhì)量濃度為5.1 g/L，發(fā)酵液中殘留底物質(zhì)量濃度為1.2 g/L，產(chǎn)物對(duì)底物的得率為68%。整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程葡萄糖消耗速率基本保持穩(wěn)定，說(shuō)明在轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞活力維持在比較穩(wěn)定的狀態(tài)。盡管隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，殘留的PPA可能會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為PLA，為了保證轉(zhuǎn)化的時(shí)間空間效率，本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化時(shí)間設(shè)定為60 min。

圖1 E. coli pET-28a-ldhY52V合成PLA過(guò)程曲線Fig.1 The curve of PLA synthesis by E. coli pET-28a-ldhY52V

2.2 樹(shù)脂的選型

通過(guò)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，得到各樹(shù)脂對(duì)于PLA和PPA的靜態(tài)吸附容量，如表1所示。其中弱堿大孔型樹(shù)脂D315和D318對(duì)PLA具有較大的交換容量，其中D315的交換容量為216.2 mg/g。不同樹(shù)脂對(duì)于PPA的吸附能力有所差異，其趨勢(shì)與對(duì)PLA的吸附能力相似。因此選擇D315作為本實(shí)驗(yàn)的離子交換填料。

表1 不同樹(shù)脂交換容量的比較Table 1 Comparison of the exchange capacity by different resin

2.3 固定床上樣條件優(yōu)化

2.3.1 流量對(duì)流出曲線的影響

不同流量對(duì)流出曲線的影響如圖2所示，隨著上樣流量的增加，穿透點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間縮短。這可能是由于上樣流量提高導(dǎo)致固液接觸時(shí)間變短，PLA不能與樹(shù)脂充分發(fā)生交換反應(yīng)使得穿透點(diǎn)提前出現(xiàn)。該結(jié)果表明過(guò)高的上樣流速會(huì)使樹(shù)脂未飽和吸附，顯著降低樹(shù)脂的利用率。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)選擇4 BV/h的流量上樣較為合理。但是根據(jù)實(shí)際的操作情況，低流量上樣耗時(shí)多，在上樣開(kāi)始階段可以選擇高流量，之后以低流量上樣至穿透以提高柱子利用率和生產(chǎn)效率。

圖2 上樣流量對(duì)流出曲線的影響Fig.2 Effect of space velocity on the effluent curve注：C為流出液中PLA的質(zhì)量濃度，C0為上樣前PLA的初始質(zhì)量濃度，下同。

2.3.2 徑高比對(duì)流出曲線的影響

徑高比對(duì)流出曲線的影響如圖3所示，當(dāng)徑高比為1∶7、1∶10和1∶15時(shí)，相對(duì)徑高比1∶5交換區(qū)域明顯拉長(zhǎng)，交換時(shí)間增加，穿透點(diǎn)顯著延后，拖尾現(xiàn)象明顯。另外，過(guò)低的徑高比容易導(dǎo)致裝填不均勻，局部交換過(guò)程受到影響，較高的徑高比流出曲線容易穿透，因此從試驗(yàn)結(jié)果看選擇徑高比為1∶7進(jìn)行裝填。

圖3 徑高比對(duì)流出曲線的影響Fig.3 Effect of resin height on the effluent curve

2.4 洗脫條件優(yōu)化

2.4.1 混合洗脫劑一步洗脫

NaCl和HCl溶液是離子交換常用的洗脫劑。首先采用不同濃度的NaCl混合洗脫劑(NaCl和HCl)對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行洗脫(如圖4)。采用10 mmol/L的HCl和NaCl混合洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫液中只含有微量的PPA和PLA，隨著混合洗脫液中NaCl濃度的升高，PLA和PPA洗脫下來(lái)的質(zhì)量濃度逐漸升高。說(shuō)明離子強(qiáng)度的提高增強(qiáng)了混合洗脫液的洗脫能力。但是在這些條件下PLA和PPA同時(shí)被洗脫下來(lái)，完全沒(méi)有達(dá)到分離的效果。這一結(jié)果說(shuō)明采用混合洗脫劑不能將發(fā)酵液中的產(chǎn)物PLA和底物PPA很好地分離。

a-10 mmol/L NaCl和10 mmol/L HCl洗脫; b-50 mmol/L NaCl和10 mmol/L HCl洗脫; c-100 mmol/L NaCl和10 mmol/L HCl洗脫圖4 NaCl濃度對(duì)洗脫曲線的影響Fig.4 Effect of different concentration of NaCl for the elution curve

考慮到pH值會(huì)影響PLA和PPA的帶電狀態(tài)，進(jìn)而改變與離子交換樹(shù)脂的作用力。調(diào)節(jié)洗脫劑的pH值可能有助于改善洗脫劑的選擇性，因此通過(guò)改變HCl濃度分析其對(duì)PLA和PPA的分離效果。為保證一定的洗脫強(qiáng)度和防止過(guò)高的NaCl濃度造成PLA和PPA的大量洗脫影響洗脫劑的選擇性，將NaCl濃度設(shè)為50 mmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。隨著HCl濃度升高，流出液中PLA和PPA的質(zhì)量濃度有所升高，低pH值使得兩種物質(zhì)的在洗脫的同時(shí)分離效果更加明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明調(diào)節(jié)洗脫劑HCl濃度有助于提高洗脫劑對(duì)PLA和PPA的分離度。

a-50 mmol/L NaCl和10 mmol/L HCl洗脫；b-50 mmol/L NaCl和50 mmol/L HCl洗脫;c-50 mmol/L NaCl和100 mmol/L HCl洗脫圖5 不同HCl洗脫濃度對(duì)洗脫曲線的影響Fig.5 Effect of different concentrations of HCl for the elution curve

2.4.2 兩階段洗脫

提高NaCl濃度可以加強(qiáng)洗脫強(qiáng)度，提高洗脫劑HCl濃度可以改善洗脫選擇性。為進(jìn)一步改善分離效果和洗脫效率，考查采用兩階段分步洗脫的效果。第一階段采用HCl單獨(dú)洗脫；第二階段由NaCl單獨(dú)洗脫。第一階段洗脫結(jié)果如圖6所示。采用100 mmol/L HCl單獨(dú)洗脫時(shí)流出液中PLA迅速洗出，在洗脫體積約60 mL時(shí)，流出液中PLA濃度達(dá)到高峰，隨后逐漸下降至較低水平。在這一過(guò)程中，盡管有微量的PPA洗脫出來(lái)，但是PLA與PPA總體獲得了較好地分離。用200 mmol/L HCl單獨(dú)洗脫時(shí)，PLA同樣被迅速洗脫，最高峰出現(xiàn)在不到50 mL洗脫體積處，因此顯得峰高而窄。盡管如此，由于提高了HCl濃度的同時(shí)也提高了洗脫劑中Cl-濃度，從而提高了對(duì)PPA的洗脫強(qiáng)度，導(dǎo)致較多量的PPA也一同被洗脫出來(lái)，這并不利于兩者的分離。因此，由圖5可知HCl濃度為100 mmol/L時(shí)分離效果較佳，因此第一階段洗脫劑選擇100 mmol/L HCl。

a-100 mmol/L HCl洗脫；b-200 mmol/L HCl洗脫圖6 不同濃度HCl對(duì)第一階段洗脫曲線的影響Fig.6 Effect of different concentrations of HCl for the first phase elution curve

第一階段用HCl單獨(dú)洗脫時(shí)，可比較有效地洗脫P(yáng)LA，但樹(shù)脂中還殘留著一定量的PPA。為提高樹(shù)脂洗脫效率和樹(shù)脂的使用壽命，第二階段利用較高濃度的200 mmol/L NaCl進(jìn)行洗脫。結(jié)合第一階段的結(jié)果，確定第二階段洗脫從洗脫體積到150 mL開(kāi)始進(jìn)行。完整的兩階段洗脫曲線如圖7所示。在第一階段洗脫液中，PPA的含量較低，PLA的純化效果較好。

圖7 階段洗脫曲線Fig.7 Stepwise elution curve

2.5 PLA離子交換分離純化效果分析

用發(fā)酵液上樣，上樣體積記為V0，收集上樣流出液和洗柱液,其體積記為V1，第一階段洗脫液體積為V2，第二階段洗脫液體積為V3，測(cè)定其中PLA和PPA的質(zhì)量濃度,結(jié)果如表2所示。第一階段HCl洗脫，收集液中PLA質(zhì)量濃度為110.6 mg/L，相應(yīng)PPA的質(zhì)量濃度為 10.7 mg/L，由初始發(fā)酵液PLA與PPA的質(zhì)量濃度比4.2提高至10.3，表明該方法有效地將PLA和PPA進(jìn)行了分離，達(dá)到了初步純化的目的。第二階段的NaCl洗脫液中PPA質(zhì)量濃度較高，有助于將殘留在樹(shù)脂中的底物洗脫。驗(yàn)證結(jié)果表明二階段分步洗脫可以改善對(duì)PLA洗脫的選擇性，有效地將發(fā)酵液中PLA與PPA進(jìn)行分離。

表2 分離純化效果分析Table 2 Consequence of purification

注：“-”代表PLA回收率不計(jì)。

3 結(jié)論

利用重組大腸桿菌E.colipET-28a-ldhY52V轉(zhuǎn)化PPA合成了PLA，通過(guò)樹(shù)脂的預(yù)處理，利用靜態(tài)吸附法篩選了吸附量最大的大孔弱堿陰離子交換樹(shù)脂D315用于分離PLA。在上樣量為1.25倍柱床體積條件下優(yōu)化結(jié)果表明，上樣流量為4 BV/h，徑高比為1∶7的裝填高度時(shí)上樣吸附效果較好。洗脫工藝采用階段洗脫效果較好：第一階段用100 mmol/L HCl作為洗脫劑，在流速為5 BV/h下洗脫約37個(gè)柱床體積，該階段PLA回收率為66.4%；第二階段采用200 mmol/L NaCl在同樣流速下洗脫約17個(gè)柱床體積。該洗脫工藝第一階段的洗脫液中PLA/PPA的質(zhì)量濃度比值由初始的4.2上升為10.3，取得一定的純化效果，第二階段有利于樹(shù)脂的清洗和再生，提高分離柱的分離效率。但是，在該條件下的分離效果和PLA回收率依然較低，本研究為進(jìn)一步改善離子交換法分離純化發(fā)酵液中PLA的工藝研究提供了初步借鑒。