乳酸菌發(fā)酵條件下葛根抗氧化能力研究※

劉曉瑩　張　寧　郭乃菲　朱麒臻　高　陽(yáng)　王　琦

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧　大連　116600）

葛根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，為豆科植物野葛的干燥根，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物。葛根中主要的功能性成分為黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)和甾體類(lèi)化合物[1]，其中黃酮類(lèi)含量最高，具有抗氧化、抗心律失常等作用[2]。酸奶中的乳酸菌與有機(jī)酸、活性酶、抗生物質(zhì)等協(xié)同對(duì)機(jī)體功能有抗氧化的作用[3]。近些年出現(xiàn)了一些葛根發(fā)酵類(lèi)食品的研制以及最佳工藝的選擇等相關(guān)方面的研究[4-5]，但具體針對(duì)葛根酸奶中抗氧化能力變化的探究較少。

1　材料與設(shè)備

1.1主要材料與試劑

1.1.1材料 純牛奶，酸奶（嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌），均為市售；葛根粉（產(chǎn)地為廣西）。

1.1.2試劑 甲醇，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，鐵氰化鉀，三氯乙酸，三氯化鐵，二苯基苦肼基，硫酸亞鐵，水楊酸，過(guò)氧化氫，硫代巴比妥酸，亞油酸，硫氰酸銨，氯化亞鐵，ABTS，過(guò)硫酸鉀，蘆丁，無(wú)水乙醇（均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；甲醇、蒸餾水（色譜純）。

1.2主要儀器與設(shè)備 UY-1500型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（翱藝儀器（上海） 有限公司）；十萬(wàn)分之一天平CP225D （Made by Sartorius）；SB-5200DT超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1酸奶制備方法 采用實(shí)驗(yàn)室自制的葛根酸奶，不添加葛根粉即為空白酸奶。

2.2總黃酮的測(cè)定方法

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作 精密稱(chēng)取蘆丁10 mg，溶于10 mL甲醇中，分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于25 mL容量瓶中定容，以甲醇為空白在250 nm下測(cè)定吸光度，以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.2.2總黃酮的測(cè)定 精密稱(chēng)取葛根粉（80目） 0.5 g，分別加入10 mL 30%甲醇、30%乙醇、水，混勻后靜置24 h，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以甲醇為溶劑溶解定容至10 mL，取1 mL定容至25 mL，以甲醇為空白在250 nm下測(cè)定吸光度。

2.3抗氧化能力測(cè)定

2.3.1還原力測(cè)定 按文獻(xiàn)[3]方法測(cè)定還原力。

2.3.2DPPH·清除率 按文獻(xiàn)[8]方法測(cè)定DPPH·清除率。

2.3.3·OH清除率 按文獻(xiàn)[9]方法測(cè)定·OH清除率。

2.3.4抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定 按文獻(xiàn)[9]方法測(cè)定抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。

2.3.5對(duì)亞油酸的抗氧化作用 按文獻(xiàn)[10]方法測(cè)定對(duì)亞油酸的抗氧化能力。

2.3.6對(duì)ABTS自由基的清除作用 按文獻(xiàn)[11]方法測(cè)定對(duì)ABTS自由基的清除作用。

3　結(jié)果

3.1總黃酮含量測(cè)定 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0.0302x-0.0067（R2=0.9995）測(cè)得圖1各值。如圖所示，葛根發(fā)酵后總黃酮含量增高，且貯藏第5 d葛根素含量最高。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能由于微生物的生命活動(dòng)，一方面有助于合成黃酮類(lèi)化合物，另一方面促進(jìn)葛根內(nèi)成分溶出。接種時(shí)球菌占優(yōu)勢(shì)的酸奶產(chǎn)品在貯存前3 d酸度上升較快，3 d后放慢[15]。前3 d酸奶pH值降低加快，抑制酶的活性，微生物代謝減慢。故在第24 h至72 h內(nèi)葛根素的含量降低但高于發(fā)酵前葛根中葛根素的含量，72 h之后葛根素含量又逐漸上升。

圖1　葛根發(fā)酵前后葛根素含量變化圖

3.2抗氧化能力分析

3.2.1還原力測(cè)定 在發(fā)酵期，葛根酸奶的還原力與空白酸奶的還原力相差不大，可能是發(fā)酵時(shí)間較短，差異并不明顯。但在發(fā)酵期與貯藏期，葛根粉酸奶的還原力明顯大于空白酸奶的還原力，結(jié)合3.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明乳酸菌的發(fā)酵作用使得整個(gè)體系中還原性成分的活性有所提高。

圖2　樣品量為1 mL時(shí)的還原力

3.2.2DPPH·清除率測(cè)定 根據(jù)回歸方程y=0.6876x+0.0512，R2=0.9998，計(jì)算清除率，如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵期兩種酸奶對(duì)DPPH·的清除率都較弱，沒(méi)有太大差異，后熟期的清除率大幅升高，且空白酸奶大于葛根粉酸奶，但是相差也不大。貯藏期兩者對(duì)DPPH·的清除率相差不大，并且總體上隨時(shí)間增長(zhǎng)其清除率不斷下降。

圖3　兩種酸奶對(duì)DPPH·清除率的對(duì)比圖

3.3.3·OH清除率測(cè)定 在該時(shí)期內(nèi)，兩種酸奶對(duì)·OH的能力都較好，且清除率差異不大，始終保持平穩(wěn)狀態(tài)。見(jiàn)圖4。

圖4　不同酸奶對(duì)·OH的清除率對(duì)比圖

3.3.4抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種酸奶都有抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力，且都不強(qiáng)，相比之下并無(wú)差異。見(jiàn)圖5。

圖5　不同酸奶抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的對(duì)比圖

3.3.5對(duì)亞油酸的抗氧化作用 兩種酸奶都具有對(duì)亞油酸的抗氧化作用，且差異不大。在抑制亞油酸方面葛根對(duì)乳酸菌可能沒(méi)有協(xié)同作用。見(jiàn)圖6。

圖6　不同酸奶對(duì)亞油酸清除能力的對(duì)比圖

3.3.6對(duì)ABTS自由基的清除作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種酸奶均在發(fā)酵期對(duì)ABTS自由基的清除率較大，在后熟期清除率驟降，在貯藏期第一天時(shí)又有所上升，仍然低于發(fā)酵期，之后呈曲折下降。見(jiàn)圖7。

圖7　對(duì)ABTS自由基清除率的對(duì)比圖

4　討論

乳酸菌的發(fā)酵作用對(duì)葛根中的黃酮類(lèi)總量產(chǎn)生了影響，使其含量發(fā)生變化。葛根素的結(jié)構(gòu)中連有糖基，且為碳苷，大豆苷連有糖基為氧苷，葛根素和大豆苷元結(jié)構(gòu)中在4'位均是羥基，刺芒柄花素和鷹嘴豆芽素A結(jié)構(gòu)中沒(méi)有糖基，4'位均是甲氧基[13]。氧苷較碳苷易水解，更容易被微生物利用，故推測(cè)微生物可能代謝利用大豆苷，產(chǎn)物是刺芒柄花素和鷹嘴豆芽素，使發(fā)酵前葛根中黃酮類(lèi)成分有所增加。