紫薯不溶性膳食纖維超聲輔助酶法提取工藝及抗氧化活性研究

薛 山

(1. 閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；2. 菌物產(chǎn)業(yè)福建省高校工程研究中心，福建 漳州 363000)

紫薯又稱紫甘薯、黑紫薯，是一種源于日本的特殊品種[1]。研究認(rèn)為紫薯不僅具有非常豐富的膳食纖維，還含有植物多酚、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)，尤其是硒元素等人體需要的營養(yǎng)成分與活性物質(zhì)[2-4]，對(duì)機(jī)體抗癌、抗氧化、防輻射、降血壓等方面都發(fā)揮著不同程度的功效[5]。目前，有關(guān)紫薯方面的研究多涉及紫薯中花青素/花色苷的提取及抗氧化活性測(cè)定[6-8]、紫薯全粉加工利用[9-10]、紫薯飲料[11]、紫薯汁糖化[12]、甘薯蜜[13]等方面，而針對(duì)紫薯膳食纖維提取方面的報(bào)道甚少，且多為水溶性的果膠類物質(zhì)[14-15]，對(duì)于不溶性膳食纖維(Insoluble dietary fiber, IDF)提取的關(guān)注有待加強(qiáng)。

膳食纖維(dietary fiber，DF)具有豐富而獨(dú)特的性質(zhì)，是人體必不可少的“第七營養(yǎng)素”[16]。1998年，Saura-Calixto[17]基于此提出了一個(gè)新概念——抗氧化膳食纖維，即大量天然抗氧化劑結(jié)合到DF基質(zhì)中的產(chǎn)物。目前，植物性膳食纖維已被證實(shí)具有顯著的抗氧化活性[18]，尤其是水不溶性膳食纖維中富含黃酮類(花色素苷、黃烷、黃酮、黃酮醇、黃烷醇)、酚酸(沒食子酸、阿魏酸)以及縮合單寧(聚合的原花色素和高分子量水解鞣質(zhì))等天然抗氧化成分[19-21]。因此，本試驗(yàn)擬以紫薯這一膳食纖維豐富的原料為對(duì)象，優(yōu)化其不溶性膳食纖維的提取工藝，并測(cè)定其體外羥自由基清除能力，以期為紫薯的綜合利用與推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫薯：漳州市沃爾瑪超市。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

α-淀粉酶：2.0×104U/g，河南亞統(tǒng)食品原料有限公司；

氫氧化鈉、鹽酸、抗壞血酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸：分析純，西隴化工股份有限公司。

1.2.2 儀器

高速萬能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

實(shí)驗(yàn)室數(shù)顯分散均質(zhì)機(jī)：AD500S-H型，上海昂尼儀器儀表有限公司；

精密電子天平：AR224CN型，奧豪斯儀器常州有限公司；

pH計(jì)：STARTER 2100型，奧豪斯儀器上海有限公司；

數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：HH-8型，常州國華電器有限公司；

臺(tái)式低速大容量離心機(jī)：L550型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理 將紫薯去皮、清洗、切成薄片，放入烘箱60 ℃鼓風(fēng)干燥至恒重，將物料充分粉碎，過40目篩，陰涼干燥處存放以備用。

1.3.2 不溶性膳食纖維的提取 參考文獻(xiàn)[22～23]并略微修改：稱取1.000 g紫薯粉(干重)，按比例加入一定的蒸餾水，充分均質(zhì)混勻，通過鹽酸(0.325 mol/L)和氫氧化鈉(0.275 mol/L)調(diào)節(jié)所需要的pH值(中偏酸性)，加入適量的α-淀粉酶溶液(50 mgα-淀粉酶溶解于1 mL pH 6.0的PBS緩沖液中)，用超聲波處理并加熱一段時(shí)間，反應(yīng)完畢后將溶液調(diào)至中性。最后，將所得的混合溶液以3 000×g離心10 min，殘?jiān)謩e用蒸餾水和無水乙醇洗滌，于105 ℃烘至恒重即得IDF粗提物。提取率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

c——提取率，%；

m1——膳食纖維的干重，g；

m2——紫薯的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

(1) 料液比對(duì)紫薯IDF提取率的影響：在超聲功率200 W、超聲時(shí)間30 min、α-淀粉酶用量50 μL/g、酶解溫度45 ℃的條件下，考察料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)時(shí)，對(duì)IDF提取率的影響。

(2) 超聲功率對(duì)紫薯IDF提取率的影響：考察超聲功率分別為120，140，160，180，200 W時(shí)，對(duì)IDF粗提率的影響。料液比為1∶15 (g/mL)，其他反應(yīng)條件同1.3.3(1)。

(3)α-淀粉酶用量對(duì)紫薯IDF提取率的影響：考察α-淀粉酶用量分別為30，40，50，60，70 μL/g時(shí)，對(duì)IDF粗提率的影響。超聲功率為160 W，其他反應(yīng)條件同1.3.3(2)。

(4) 超聲時(shí)間對(duì)紫薯IDF提取率的影響：考察超聲時(shí)間分別為10，20，30，40，50 min時(shí)，對(duì)IDF粗提率的影響。α-淀粉酶用量為50 μL/g，其他反應(yīng)條件同1.3.3(3)。

(5) 酶解溫度對(duì)紫薯IDF提取率的影響：考察酶解溫度分別為30，45，60，75，90 ℃時(shí)，對(duì)IDF粗提率的影響。超聲時(shí)間為40 min，其他反應(yīng)條件同1.3.3(4)。

1.3.4 多因素試驗(yàn) 由單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果作為依據(jù)。將單因素試驗(yàn)的4個(gè)主要因素作為考察對(duì)象，設(shè)計(jì)了四因素三水平表IDF提取的正交試驗(yàn)。

1.3.5 清除·OH的測(cè)定方法 參考陳琬盈等[24]方法配制待測(cè)液。在1 000 mL的三角瓶中加入提取的IDF 5.0 g，加水400 mL，攪拌均勻后浸泡l h，加熱液體至沸騰后保持20 min，于13 000 r/min下均質(zhì)1 min，將乳濁液定容到500 mL 容量瓶。試驗(yàn)時(shí)，根據(jù)需要稀釋成不同濃度的待測(cè)液。參照固體粉末抗氧化法測(cè)定樣品液在Fenton 反應(yīng)體系產(chǎn)生的羥自由基[25-26]：分別在試管中加入1.0 mL不同濃度的IDF，并依次添加9.0 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、9.0 mmol/L Fe2+溶液各0.5 mL，加入88 mmol/L H2O25.0 mL 來啟動(dòng)該反應(yīng)。振蕩搖勻在37 ℃水浴反應(yīng)30 min，混合溶液于9 200×g離心2 min，收集上清液于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光值。同時(shí)，以VC作為陽性對(duì)照。清除率按式(2)計(jì)算，并換算半數(shù)抑制率IC50。

(2)

式中：

P——·OH清除率，%；

A1——0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL膳食纖維+0.5 mL Fe2++5.0 mL H2O2混合液的吸光值；

A2——0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL膳食纖維+0.5 mL 蒸餾水+5.0 mL H2O2混合液的吸光值；

A3——0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL蒸餾水+0.5 mL Fe2++5.0 mL H2O2混合液的吸光值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析方法 所有數(shù)據(jù)均用3次平行試驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，用 SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，方差分析中P<0.05為顯著差異，圖中用字母標(biāo)記法表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)紫薯IDF提取率的影響 由圖1可知，料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著(P<0.05)。在料液比為1∶15 (g/mL)時(shí)，IDF的提取率達(dá)到最大值，而后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這可能是物料過多，不能在溶液中充分膨脹；物料太少，纖維素容易水解[27]，也可能是隨著料液比的增加，混合體系中的其他物質(zhì)會(huì)競(jìng)相溶出、相互作用，影響酶反應(yīng)或膳食纖維分子的穩(wěn)定性。因此，認(rèn)為料液比在1∶15 (g/mL)時(shí)結(jié)果最優(yōu)。

圖1 料液比對(duì)紫薯IDF提取率的影響

Figure 1 Effect of material liquid ratio on the extraction rate of purple sweet potato IDF

2.1.2 超聲功率對(duì)紫薯IDF提取率的影響 超聲波作用的功效由原料的數(shù)目和結(jié)構(gòu)特性決定，每一種提取物都有其相應(yīng)的超聲功率的提取值。由圖2可知，超聲波功率在160 W時(shí)，IDF的提取率達(dá)到最大值。這可能是當(dāng)超聲波功率提升時(shí)，細(xì)胞中的IDF溶出，但當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，細(xì)胞中溶出的物質(zhì)含有降解IDF的酶，致使提取率降低[28-29]。因此，超聲功率選用160 W。

圖2 超聲功率對(duì)紫薯IDF提取率的影響

Figure 2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of purple sweet potato IDF

2.1.3α-淀粉酶用量對(duì)紫薯IDF提取率的影響 由圖3可知，隨著α-淀粉酶添加量的增加，紫薯IDF的提取率也隨之升高(P<0.05)。當(dāng)α-淀粉酶的添加量在50 μL/g時(shí)，提取率最高，當(dāng)α-淀粉酶的添加量繼續(xù)增加，IDF的提取率反而降低。推測(cè)原因可能是α-淀粉酶添加量過低時(shí)，淀粉沒能完全水解，而淀粉酶加入量太高，造成其中的半纖維素等物質(zhì)溶出，導(dǎo)致提取率下降[30]。故α-淀粉酶的添加量選用50 μL/g。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)紫薯IDF提取率的影響 研究[31]認(rèn)為，超聲波是一種頻率在 20 kHz 以上的聲波，其對(duì)媒質(zhì)主要產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用。故超聲輔助溶劑萃取法能夠顯著提高諸多功效成分的提取[31-33]。由圖4可知，超聲時(shí)間為10～40 min時(shí)，紫薯IDF的提取率與超聲時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)。超聲時(shí)間為40 min時(shí)，提取率達(dá)到峰值。推測(cè)可能是超聲時(shí)間的延長(zhǎng)有助于有效物質(zhì)的溶出，但當(dāng)超

圖3 α-淀粉酶用量對(duì)紫薯IDF提取率的影響

Figure 3 Effect of the amount of alpha amylase on the extraction rate of purple sweet potato IDF

圖4 超聲時(shí)間對(duì)紫薯IDF提取率的影響

Figure 4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of purple sweet potato IDF

聲時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞中分解IDF的酶也被溶出，造成提取率降低。故超聲時(shí)間選擇40 min。

2.1.5 酶解溫度對(duì)紫薯IDF提取率的影響 由圖5可知，IDF的提取率隨著酶解溫度的上升而逐步升高，在75 ℃時(shí)提取率最大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，提取率反而迅速下降(P>0.05)。當(dāng)溫度達(dá)到蛋白質(zhì)變性溫度范圍后，分子快速的運(yùn)動(dòng)，使酶牢固的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)鍵被打破，該變性作用時(shí)常造成蛋白質(zhì)聚集而導(dǎo)致酶失活[34]。綜上，酶解溫度選擇75 ℃ 比較合適。

2.2 正交因素試驗(yàn)結(jié)果

為了優(yōu)化提取工藝條件，依據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果(α-淀粉酶的添加量為50 μL/g)，以紫薯的IDF提取率為指標(biāo)，選擇超聲功率、超聲時(shí)間、酶解溫度、料液比作為考察因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝。紫薯正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1，紫薯正交試驗(yàn)結(jié)果表見表2。

圖5 酶解溫度對(duì)紫薯IDF提取率的影響

Figure 5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction rate of purple sweet potato IDF

表1 紫薯的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Orthogonal experimental design of purple sweet potato

表2 紫薯的正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal test of purple sweet potato

由表9可知，酶解溫度是超聲波輔助酶法提取紫薯IDF的最關(guān)鍵控制因素，其次依次是料液比、超聲波時(shí)間和超聲波功率。從k值可知，最優(yōu)工藝組合是A2B2C2D2，即超聲波功率160 W、超聲波時(shí)間40 min、酶解溫度75 ℃、料液比1∶15 (g/mL)。

2.3 最優(yōu)組合的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果和分析可得到提取的最佳工藝條件為：超聲功率160 W、超聲時(shí)間40 min、酶解溫度75 ℃、料液比1∶15 (g/mL)。用最佳的工藝組合對(duì)紫薯的IDF進(jìn)行提取，得到提取率為(38.32±0.22)%，證實(shí)了A2B2C2D2為最優(yōu)組合。

2.4 紫薯的IDF對(duì)·OH的清除結(jié)果

由圖6可知，伴隨濃度的增加，紫薯IDF和VC對(duì)·OH的清除率都隨之升高(P<0.05)。紫薯IDF的濃度為1～3 mg/mL，清除率上升較為緩慢，但在3～5 mg/mL時(shí)，清除率的上升較為顯著。經(jīng)計(jì)算，紫薯IDF的IC50為39.27 mg/mL，VC的IC50為13.15 mg/mL(圖7)。由此可見，紫薯IDF對(duì)·OH有良好的清除效果。

紫薯IDF的抗氧化性主要是基于結(jié)合在IDF上的酚類物質(zhì)[18,35]。孫海燕[3]研究發(fā)現(xiàn)，紫薯中的主要酚類物質(zhì)中類黃酮最高，含量高達(dá) (7.38 ± 0.21) mg/g； 單體酚種類最高達(dá) 10 種，其中兒茶素的含量最高為4.54 mg/L。紫羅蘭和秦紫一號(hào)2種紫薯均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，且紫薯中的各酚類物質(zhì)均與不同的抗氧化方法有顯著的相關(guān)性。蔡湛等[36]評(píng)價(jià)了紫薯的抗氧化性并通過UPLC-ESI-MS 鑒定出了7種紫薯花色苷和3種其他酚類物質(zhì)，其中花色苷中酰基化的基團(tuán)主要為咖啡酸、阿魏酸和對(duì)羥基苯甲酸，其他酚類物質(zhì)主要是綠原酸。紫薯中的酚類含量不僅遠(yuǎn)高于普通甘薯[37]，其花色苷含量也非常豐富，且具有較好的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性[38]，這些強(qiáng)活性物質(zhì)有相當(dāng)一部分會(huì)結(jié)合在膳食纖維上，成為抗氧化功效發(fā)揮的基礎(chǔ)。此外，李潤(rùn)國等[39]也報(bào)道了紫薯膳食纖維對(duì)1,1-二苯基-2-苦味酰基自由基、超氧陰離子自由基以及羥自由基的清除功效。

圖6 紫薯IDF對(duì)·OH的清除率Figure 6 The clearance rate of purple sweet potato IDF to ·OH

圖7 紫薯IDF和VC的IC50值Figure 7 IC50 value of purple sweet potato IDF and Vc

3 結(jié)論

運(yùn)用超聲波輔助酶法提取紫薯IDF簡(jiǎn)便可行，料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、α-淀粉酶用量和酶解溫度均能夠影響IDF的提取率，其中酶解溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最為顯著。正交優(yōu)化試驗(yàn)最終得到的提取工藝參數(shù)為：α-淀粉酶添加量50 μL/g、料液比1∶15 (g/mL)、超聲時(shí)間40 min、超聲功率160 W和酶解溫度75 ℃，該條件下提取率可達(dá)38.32%。體外抗氧化試驗(yàn)表明，紫薯IDF具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。這可能與膳食纖維中結(jié)合的花色苷或活性酚類等抗氧化物質(zhì)有關(guān)。

如今，許多果蔬中的抗氧化膳食纖維已廣泛應(yīng)用于食品保鮮與功能食品研發(fā)等領(lǐng)域[40]。紫薯作為良好的膳食纖維來源，具有廣闊的市場(chǎng)前景，亟待更深入的研究和利用。