分散固相萃取結合HPLC-MS/MS同時測定茶葉中丁醚脲及其降解產物

肖利民 王美玲 戴潔蕓 戴 華

(1. 長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410076；2. 湖南出入境檢驗檢疫局，湖南 長沙 410004)

茶葉是中國重要的農產品之一，在生產過程中，為了保證茶葉的產量，防治茶樹的病蟲害，農藥的用量和種類也逐漸增多，使得農藥殘留成為茶葉安全最突出的問題之一。丁醚脲是一種新型高效的硫脲類選擇性殺蟲、殺螨劑，具有較低毒性，主要通過影響昆蟲呼吸作用、干擾能量轉換和轉化為具有更高毒性的降解產物，達到殺蟲目的[1]，被廣泛用于茶樹上，對蚜蟲、葉蟬、粉虱、蛾和螨類具有很好的殺滅效果[2-3]。但丁醚脲易發(fā)生光解、水解以及生物降解，也可在植物體內發(fā)生降解，形成丁醚脲-酰胺體、丁醚脲-脲等降解產物[4]。研究結果[5]表明丁醚脲的降解產物，比丁醚脲原藥本身具有更高的毒性。這些分解產物還對肺、肝臟等靶器官的毒性具有積累作用[6]。隨著丁醚脲的廣泛使用，必然會對環(huán)境及食物造成污染，威脅人類健康。為此一些發(fā)達國家和地區(qū)都制定了嚴格的茶葉中丁醚脲殘留限量標準。歐盟、美國等規(guī)定不得檢出，歐盟于2002 年頒布了第2076/2002 號法規(guī)，明令禁止使用和銷售丁醚脲。日本、澳大利亞等國家規(guī)定茶葉中丁醚脲及其2種降解產物的最大殘留限量總值為20 mg/kg。中國GB 2763—2016《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規(guī)定了丁醚脲在茶葉中臨時最大殘留限量為5 mg/kg。與歐盟標準相比，中國規(guī)定的茶葉中丁醚脲的殘留限量較高，同時未說明應包括丁醚脲降解產物包含在內，造成丁醚脲殘留檢測結果偏低或檢測不出，給茶葉中丁醚脲農藥殘留的控制帶來很大影響，也達不到出口茶葉丁醚脲殘留限量檢測要求。因此，建立茶葉中丁醚脲及其降解產物殘留量的檢測方法具有重要意義。

目前報道的主要是水[7]、蔬菜[8]、水果及土壤等[9-10]基質中丁醚脲殘留分析的方法，雖有少數(shù)文獻報道了茶葉中丁醚脲殘留的檢測，如呂慧芝等[11]采用QuEChERS-高效液相色譜液質聯(lián)用法測定茶葉中的丁醚脲殘留量，定量限為0.01 mg/kg，回收率為70.4%～110.1%，但只包括丁醚脲原藥降解產物分析；董曉倩等[12]建立的茶葉中丁醚脲農藥殘留檢測的液相色譜—串聯(lián)質譜方法，研究了丁醚脲在紫外光下的分解，及丁醚脲—甲酰胺、丁醚脲—脲的質譜檢測方法，沒有定量檢測數(shù)據(jù)；張新忠等[13]采用超高效液相色譜—串聯(lián)質譜建立了測定茶葉和土壤中丁醚脲及其1種降解產物——丁醚脲—脲殘留量的方法。由于丁醚脲的半衰期較短，茶葉中的丁醚脲在生產、運輸、存儲過程以及樣品檢測分析過程中都會分解、降解，產生丁醚脲—甲酰胺、丁醚脲—脲等降解產物，大多情況下，因為丁醚脲的降解，導致樣品中難以檢測到丁醚脲原藥的殘留，因此茶葉中丁醚脲農藥的殘留量應以丁醚脲及其降解產物總量來計算。不對茶葉中丁醚脲及其2種降解產物進行同時定性、定量分析，易造成漏檢、檢測結果偏低，不能準確反映茶葉中丁醚脲的實際殘留量，達不到殘留水平監(jiān)測的目的。

茶葉樣品基體復雜，雜質干擾嚴重，同時因為丁醚脲的降解、異構化、衍生作用，給分離檢測技術帶來很大的阻礙。本研究擬采用高效液相色譜—串聯(lián)質譜技術，結合QuEChERS凈化方法，建立茶葉中丁醚脲及其2種降解產物(丁醚脲—脲及丁醚脲—甲酰胺)殘留量同時定性、定量測定的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

三重四級桿串聯(lián)質譜儀：API 4000型，配電噴霧離子源(ESI)，美國Applied Biosystems公司；

高效液相色譜儀：SHIMADZU LC-20A型，日本島津公司；

超純水系統(tǒng)：MILLI-Q Gradient型，美國密理博公司；

快速混勻器：SK-1型，常州澳華儀器有限公司；

切割式混合研磨儀：GM200型，德國Retsch公司；

高速離心機：1-15P型，德國Sigma公司；

丁醚脲標準品：純度>99.9%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；

丁醚脲—脲、丁醚脲—甲酰胺標準品：純度>99.0%，日本和光純藥工業(yè)株式會社；

甲醇、乙腈、乙酸：色譜純，德國Merck公司；

其他試劑均為分析純；

試驗用水：超純水，美國Millipore超純水儀制備；

N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑(40～60 mm)、石墨化炭黑(GCB)吸附劑(120～400目)：上海安譜科學儀器有限公司；

茶葉：市售。

1.2 標準溶液配制

分別稱取10.0 mg丁醚脲、丁醚脲—脲和丁醚脲—甲酰胺標準品，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，并轉移至棕色樣品瓶中，-20 ℃ 避光下保存以防止丁醚脲分解。將標準貯備溶液用空白基質逐級稀釋為標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 稱取粉碎后的茶葉樣品1 g(精確至0.001 g)于50 mL塑料離心管中(鋁箔紙包裹)，加入0.2 g無水硫酸鎂、0.2 g氯化鈉和10 mL乙腈，渦旋混勻3 min，振蕩提取10 min，于6 000 r/min離心3 min，收集上清液，待凈化。

1.3.2 凈化 取上清液1.0 mL于1.5 mL離心管中，加入0.15 g 無水硫酸鎂、0.05 g GCB吸附劑和0.05 g PSA吸附劑，旋渦振蕩1 min，10 000 r/min離心3 min。取凈化液經0.22 μm有機微孔濾膜過濾于棕色進樣小瓶，待測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相A為0. 1%乙酸水溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～4 min、20% B～70% B，4～8 min、70% B～95% B，8～12 min、95% B，12.0～12.1 min、95% B～20% B，12.1～18.0 min、20% B；柱溫：40 ℃，進樣量：10 mL。

1.5 質譜條件

離子源：ESI，正離子掃描；氣簾氣：68.9 kPa；霧化氣 (GS1)：275.8 kPa；輔助加熱氣 (GS2)：344.8 kPa；碰撞氣 (CAD)：48.3 kPa；電噴霧電壓 (IS)：5 000 V；離子源溫度 (TEM)：450 ℃；定性離子對、定量離子對、去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)，具體見表1。

2 結果與討論

2.1 色譜和質譜條件的優(yōu)化

分別考察了甲醇—水、乙腈—水(含0.1%乙酸)以及乙腈—5 mmol/L 乙酸銨3種流動相體系對分離效果及靈敏度等影響。結果發(fā)現(xiàn)，以甲醇—水或乙腈—5 mmol/L乙酸銨作為流動相時，丁醚脲峰型較寬，響應不高。采用乙腈—0.1% 乙酸作為流動相以及梯度洗脫模式，3種化合物均可獲得較好的分離，峰形尖銳且響應值高，雜質干擾少，故確定為最終的液相條件。在此色譜條件下，出峰時間順序依次為丁醚脲—甲酰胺、丁醚脲—脲和丁醚脲。

表1 丁醚脲及其降解產物的質譜參數(shù)?Table1 HPLC-MS/MS parameters for diafenthiuron and its degradation products

? “*”表示定量離子對。

丁醚脲及其降解物在ESI+或ESI-離子模式下均有響應，因該類化合物均含有氨基基團，易在正模式下形成[M+H]+離子，因而選取ESI+模式測定，靈敏度更高。同時對質譜的離子源溫度、霧化氣、輔助加熱氣等參數(shù)進行優(yōu)化，使各化合物的質譜響應信號達到最佳。

2.2 樣品提取和凈化條件優(yōu)化

考察了乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷等有機溶劑對目標化合物提取效率的影響。結果表明，相對于其他溶劑，采用乙腈作為提取劑，因其滲透性強、溶解性良好，不僅可獲得較高的提取回收率，而且提取液中茶多酚、咖啡堿、色素等共萃物較少，有利于后續(xù)的進一步凈化[12-13]。試驗中比較了加水浸泡與不加水浸泡對于干茶葉中丁醚脲及其降解產物提取的影響。結果表明，加水浸泡反而降低干茶葉樣品中丁醚脲及其降解產物的提取率。一方面是丁醚脲含有硫脲基在見光及水環(huán)境中易降解，圖1為丁醚脲在水溶液(200 ng/mL)中室溫放置24 h后的降解情況。由圖1可見，丁醚脲在水溶液中分解速度較快，0.5 h后便降解64%，同時檢測到2種降解產物丁醚脲—甲酰胺和丁醚脲—脲。丁醚脲—甲酰胺的濃度隨時間不斷增加，24 h后濃度增加26倍。而丁醚脲—脲自前0.5 h濃度增加為原來的2.5倍，之后隨時間的延長濃度基本不變。這表明丁醚脲在見光及水環(huán)境中易降解，但除了降解產生丁醚脲—甲酰胺和丁醚脲—脲外(圖2)，還可能有其他機理的降解發(fā)生[6]，需進一步研究。另一方面，加水浸泡后，提取液色素明顯加重，一些極性物質會被提取出來，干擾更嚴重。茶葉中富含大量生物堿、色素和多酚類物質，基質干擾嚴重，一般需采用固相萃取柱或凝膠滲透色譜凈化，再經過濃縮、復溶等過程。不僅前處理時間較長，步驟繁瑣，而且由于丁醚脲的不穩(wěn)定性，還會導致丁醚脲的分解，使得回收率偏低。因此簡單、快速的前處理凈化方法有助于減少或避免丁醚脲的分解，準確地獲得樣品中丁醚脲及其降解產物的實際殘留量。本研究參考已有文獻[11-12]方法，采用QuEChERS凈化法， PSA吸附劑用于去除茶葉提取液中的脂肪酸、酚類等雜質，GCB吸附除茶葉提取液中色素成分。無水硫酸鎂去除提取液中的水分，提高回收率。該方法簡單、快速、前處理用時短。由于丁醚脲見光容易降解，因此試驗過程中要注意避光，采用的塑料離心管需用鋁箔紙包裹。

2.3 基質效應

液相色譜-質譜進行檢測時，由于基質成分和目標化合物在離子化時存在相互競爭，常常會增強或抑制待測物的離子化作用，從而影響分析結果的準確性。本研究分別以乙腈和空白茶葉樣品基質配制混合標準工作溶液，以峰面積比為縱坐標、質量濃度為橫坐標繪制標準曲線(圖3)，比較兩者的斜率以確定基質效應的強弱。試驗結果發(fā)現(xiàn)，不同茶葉樣品中丁醚脲和丁醚脲—脲均存在一定的基質抑制效應。因此采用空白樣品基質溶液配制標準工作溶液進行定量分析，以消除基質效應的影響。

圖1 在水溶液中丁醚脲(200 ng/mL)隨時間的變化

Figure 1 The changes of diafenthiuron in aqueous solution at the concentration of 200 ng/mL

圖2 丁醚脲降解規(guī)律圖Figure 2 The proposed degradation pathways of diafenthiuron

2.4 線性范圍、檢出限、定量限、回收率和精密度

采用空白基質配制系列不同濃度的混合標準溶液進行測定，以各組分定量離子的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制工作曲線, 得到的線性回歸方程，相關系數(shù)r為0.990～0.995(表2)，表明各化合物在響應的濃度范圍內呈良好的線性關系，外標法定量。以3倍信噪比(S/N)響應時所對應的質量濃度作為檢出限(LOD)。以10倍信噪比對應的質量濃度作為定量限(LOQ)，經樣品添加試驗確定丁醚脲、丁醚脲—甲酰胺和丁醚脲—脲的檢出限分別為0.005，0.002，0.001 mg/kg，定量限分別為0.010，0.005，0.003 mg/kg。在空白綠茶樣品中添加3個不同濃度水平的混合標準溶液進行添加回收試驗，每個添加水平平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差見表2。結果表明，3個添加水平下各化合物平均回收率為62.2%～99.6%；精密度為1.3%～9.4%(相對標準偏差)。綠茶空白樣品及加標樣品的多反應監(jiān)測色譜圖見圖4。

圖3 乙腈和空白茶葉樣品基質配制混合標準工作 溶液的曲線圖

Figure 3 The standard curves of mixed standard prepared with acetonitrile and sample ma trix,respectively

2.5 實際樣品測定

應用本方法對457個茶葉樣品進行檢測，有79個樣品同時檢出有丁醚脲—甲酰胺和丁醚脲—脲，含量分別為0.008～1.690，0.013～1.320 mg/kg，其中3個樣品檢出有丁醚脲，含量為0.011～0.054 mg/kg。結果表明丁醚脲在茶葉的殘留檢測主要以降解產物的形式存在。

圖4 空白樣品和添加0.01 mg/kg混合標準品的樣品的MRM離子流色譜Figure 4 Multiple reaction monitor(MRM)chromatograms of a blank green tea sample and spiked with standards at 0.01 mg/kg for each compound表2 3種化合物的線性范圍、相關系數(shù)、定量限、平均回收率及精密度Table 2 Linear range, correlation coefficients (r) , limits of quantitation (LOQ), recoveries and precisions (relative standard deviations，RSDs) of 3 degradation products (n=6)

化合物名稱線性范圍/(ng·mL-1)相關系數(shù)r定量限/(mg·kg-1)添加水平/(mg·kg-1)平均回收率/%精密度/%0.0162.29.4丁醚脲1.0～500.00.9950.0100.0570.53.61.0085.46.00.00571.98.1丁醚脲—甲酰胺0.5～100.00.9900.0050.01086.85.30.05090.16.20.00585.47.6丁醚脲—脲0.5～100.00.9930.0030.01090.05.10.05099.61.3

3 結論

利用高效液相色譜—串聯(lián)質譜法結合QuEChERS前處理技術，建立了茶葉中丁醚脲原藥及其2種降解產物殘留量的檢測方法。該方法定性分析的同時并能對3種化合物進行準確定量，得到丁醚脲及其降解產物的總量，準確反映了茶葉中丁醚脲的實際殘留量，滿足殘留監(jiān)測的要求。并考察了丁醚脲在溶液中的降解情況，優(yōu)化前處理方法，有效避免了丁醚脲在前處理過程的降解，回收率穩(wěn)定且重現(xiàn)性較好。然而丁醚脲在茶葉中的降解機理有待進一步研究。