ER陽性乳腺癌中西達(dá)本胺逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌耐藥

周 游，王雅楠，張 堃，朱靜忠，寧志強(qiáng)

深圳微芯生物科技股份有限公司，廣東深圳 518057

雌激素受體(estrogen receptor, ER)陽性乳腺癌約占全部乳腺癌的70%，ER陽性乳腺癌細(xì)胞具有依賴雌激素生長的特性[1]．內(nèi)分泌治療是大多數(shù)激素受體陽性乳腺癌首選治療手段，通過降低體內(nèi)雌激素水平(芳香化酶抑制劑和卵巢功能抑制劑)或抑制雌激素與ER的結(jié)合活性(選擇性ER調(diào)節(jié)劑)，抑制腫瘤細(xì)胞生長．常用的乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物有他莫昔芬、氟維司群、來曲唑、阿那曲唑和依西美坦等[2]．但是，由于乳腺癌細(xì)胞本身及其周邊微環(huán)境的改變，如ER突變或表達(dá)量變化、腫瘤細(xì)胞對(duì)激素依賴性下降或激素敏感性增加、微環(huán)境生長因子提供旁路增殖信號(hào)等，約1/3的患者在長期內(nèi)分泌藥物治療后仍出現(xiàn)耐藥和復(fù)發(fā)[3-4]．目前，臨床也在嘗試各種不同作用機(jī)制藥物與傳統(tǒng)內(nèi)分泌治療藥物序貫或聯(lián)合應(yīng)用以延長疾病控制時(shí)間，已獲批的藥物包括旁路生長信號(hào)PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑everolimus，ER下游細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK4/6)抑制劑palbociclib等[5-6]．此外包括組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制劑等多種藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)[7]．

西達(dá)本胺(chidamide, Chida.)是中國首個(gè)上市的HDAC抑制劑藥物，已被批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)/難治性外周T細(xì)胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma, PTCL)治療[8]．體外研究顯示，西達(dá)本胺能顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的周期阻滯和細(xì)胞凋亡，同時(shí)對(duì)自然殺傷細(xì)胞(nature kill cells, NK cells)和抗原依賴的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)介導(dǎo)的抗腫瘤免疫活性具有明顯的促進(jìn)，另外在誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞分化、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal, EMT)方面也有作用，對(duì)增強(qiáng)耐藥腫瘤對(duì)藥物的敏感性和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[9-11]．本研究在體外培養(yǎng)的ER陽性乳腺細(xì)胞株以及相應(yīng)的裸鼠原位移植瘤模型上，考察和驗(yàn)證了西達(dá)本胺與內(nèi)分泌治療藥物的體內(nèi)外聯(lián)合治療藥效．

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所使用反應(yīng)試劑3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium(MTS)購自美國Promega公司，吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate, PMS)購自美國Sigma-Aldrich公司．Western blot實(shí)驗(yàn)所使用的一抗包括MEK1/2、phospho-MEK1/2(S217/221)、p44/42 MAPK (Erk1/2)、phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204)、mTOR、phospho-mTOR (Ser2448)、akt、phospho-akt (Ser473)、p70 S6 kinase、phospho-p70 S6 kinase (Thr389)，均購自美國Cell Signaling Technology公司；此外，Estrogen receptor alpha和Estrogen receptor alpha (phospho S118) 的一抗購自英國Abcam公司．上述抗體種屬來源均為兔，使用二抗為goat anti-rabbit IgG antibody, HRP-conjugate(Merck Millipore)．內(nèi)參β-actin一抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，種屬來源為鼠，使用二抗為Goat Anti-Mouse IgG Antibody, HRP-conjugate (Merck Millipore)．免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)使用Ki-67一抗(kit-0005)、相應(yīng)二抗HRP-polymer anti-mouse/rabbit IHC kit(kit-5010)及DAB染色液(Kit-0014)和蘇木素染色液(CTS-1099)等均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與細(xì)胞系

西達(dá)本胺原料藥由深圳微芯生物科技股份有限公司自行合成，檢驗(yàn)合格后用于本研究；4-羥他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen, 4-OH TAM)、氟維司群(fulvestrant, Ful.)及雌二醇(β-estradiol, E2)均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；上皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自上海生工生物工程有限公司．實(shí)驗(yàn)所用化合物均以DMSO為溶劑配制成一定濃度的儲(chǔ)備液，再根據(jù)需要加入到實(shí)驗(yàn)體系中，使化合物達(dá)到指定終濃度，在對(duì)照組中均加入了與實(shí)驗(yàn)組等體積的DMSO．

ER陽性人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自美國國家典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)．常規(guī)培養(yǎng)條件為含0.1 g/L青鏈霉素及10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(dulbecco’s modified eagle medium)；E2依賴性增殖培養(yǎng)條件為在含0.1 g/L青鏈霉素及10%(體積分?jǐn)?shù))活性炭處理胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)液中添加10 nmol/L E2．上述雙抗、血清和培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中．

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增殖期的MCF-7細(xì)胞，采用E2依賴性增殖培養(yǎng)條件按3 000個(gè)/孔接種到96孔培養(yǎng)板中．24 h后向培養(yǎng)液中分別加入或不加入EGF(終質(zhì)量濃度10 ng/mL)，以及特定終濃度的Chida.(0 μmol/L或0.5 μmol/L)聯(lián)合不同終濃度的4-OH TAM，或相應(yīng)的溶劑對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后加入MTS檢測(cè)試劑，即MTS和PMS溶液按體積比20∶ 1混合后每孔加入10 μL，37 ℃孵育2 h后用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測(cè)光密度值．藥物作用后以溶劑對(duì)照組光密度值OD(490)作為參照計(jì)算和比較細(xì)胞相對(duì)生長率．

1.4 蛋白表達(dá)與磷酸化水平檢測(cè)

以E2依賴性增殖培養(yǎng)條件在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，分別加入或不加入10 ng/mL EGF和(或)0.5 μmol/L Chida.，作用24 h后提取總蛋白(M-PER?哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑，Thermo scientific，78501)，采用Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)及磷酸化水平，即蛋白樣品經(jīng)定量、SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜后，利用針對(duì)目標(biāo)蛋白特異的抗體(一抗)進(jìn)行雜交反應(yīng)，隨后以相應(yīng)的二抗及其偶聯(lián)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行相對(duì)定量．

1.5 動(dòng)物荷瘤模型構(gòu)建

6～8周齡雌性NOD/SCID小鼠購自北京華阜康生物技術(shù)有限公司，在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，溫度、濕度控制與清潔按常規(guī)進(jìn)行．裸鼠檢疫合格后接種MCF-7細(xì)胞，以1×105μL-1無血清無抗生素培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，與等體積Matrigel(BD Biosciences, 356234)混合，采用乳腺原位方式接種混合液200 μL/鼠，同時(shí)埋入雌激素片(0.36 mg/片，Innovative Research)．定期監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量和腫瘤體積，待腫瘤平均體積達(dá)136 mm3時(shí)，根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)分為4組(溶劑對(duì)照組、Chida.單藥組、Ful.單藥組和Chida.+Ful.聯(lián)合給藥組)，每組8只．

1.6 動(dòng)物藥效實(shí)驗(yàn)

制備0.02 g/L羧甲基纖維素鈉和0.1% (體積分?jǐn)?shù))吐溫-80的混懸液作為灌胃給藥的溶劑，根據(jù)受試動(dòng)物體質(zhì)量，Chida.單藥組及聯(lián)合給藥組以20 mg/kg劑量Chida.每天灌胃給藥1次(quaque die, QD)，對(duì)照組則每天灌胃等量溶劑．此外，F(xiàn)ul.單藥組和聯(lián)合給藥組每周1次皮下注射(quaque week，QW)50 mg/kg劑量的Ful.．每3 d測(cè)量1次腫瘤體積和動(dòng)物體質(zhì)量，給藥6周后，按標(biāo)準(zhǔn)操作要求處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，摘取腫瘤組織，稱量腫瘤質(zhì)量后分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定，室溫保存．

1.7 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

將固定于甲醛溶液中的腫瘤組織取出水洗，在遞增梯度濃度乙醇溶液中漸次浸泡脫水、二甲苯透明后石蠟包埋和組織切片．切片附著于載玻片后，依次通過二甲苯脫蠟、遞減梯度濃度乙醇浸泡復(fù)水、在檸檬酸鈉緩沖液中進(jìn)行抗原熱修復(fù)、雙氧水孵育消除過氧化物酶，PBS清洗后滴加羊血清封閉．

完成封閉后，在組織切片上滴加一抗工作液，置濕盒4 ℃孵育過夜．一抗孵育完成后，經(jīng)PBS清洗，滴加二抗工作液，室溫孵育15 min．PBS清洗后進(jìn)行DAB顯色反應(yīng)，反應(yīng)完成經(jīng)蘇木素溶液復(fù)染、鹽酸溶液分化、乙醇(濃度梯度遞增)浸泡脫水、二甲苯透明后滴加中性樹脂、蓋玻片封片．在20×物鏡下觀察染色結(jié)果，隨機(jī)視野拍照．

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中兩組間的差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.01時(shí)認(rèn)為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義．

2 結(jié)果及分析

2.1 4-OH TAM及聯(lián)合Chida.對(duì)乳腺癌細(xì)胞系增殖的影響

4-OH TAM是他莫昔芬的活性代謝產(chǎn)物，在體外水平測(cè)試不同作用濃度的4-OH TAM單藥及聯(lián)合0.5 μmol/L Chida.時(shí)對(duì)MCF-7細(xì)胞E2依賴性增殖的影響．結(jié)果表明，4-OH TAM單藥作用72 h已對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖具有一定抑制作用，且隨著作用劑量的升高，抑制作用趨于明顯．0.5 μmol/L Chida.單藥作用于MCF-7細(xì)胞時(shí)，約10%的細(xì)胞增殖受到了抑制；0.5 μmol/L Chida.聯(lián)合不同劑量4-OH TAM存在于培養(yǎng)體系中時(shí)，二者增殖抑制藥效在一定劑量范圍內(nèi)具有疊加效應(yīng)(圖1)．

圖1 4-OH TAM及聯(lián)合Chida.對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of 4-OH TAM combined with Chida.on proliferation of MCF-7

2.2 Chida.對(duì)EGF引起乳腺癌細(xì)胞內(nèi)分泌治療耐受的逆轉(zhuǎn)

EGF是上皮細(xì)胞增殖刺激因子，在缺乏外源雌激素或雌激素依賴的生長信號(hào)通路被抑制時(shí)，ER陽性乳腺癌細(xì)胞可以轉(zhuǎn)而依賴腫瘤基質(zhì)細(xì)胞或其他腫瘤微環(huán)境細(xì)胞產(chǎn)生的EGF因子維持其增殖生長．如圖2，E2依賴性增殖的MCF-7細(xì)胞在10 ng/mL EGF作用時(shí)，相對(duì)于無EGF條件時(shí)，并未表現(xiàn)出額外增殖(P>0.05)； 4-OH TAM(2.5 μmol/L或5 μmol/L)對(duì)E2依賴性增殖的MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生約13%和25%的抑制時(shí)，10 ng/mL EGF可在一定程度上抵抗4-OH TAM對(duì)細(xì)胞增殖的抑制(抑制率分別降至0和12%，P<0.01)， 表現(xiàn)為MCF-7細(xì)胞對(duì)4-OH TAM的耐藥．4-OH TAM與0.5 μmol/L Chida.共同處理時(shí)，藥效發(fā)生疊加，EGF所引起的4-OH TAM耐藥也被Chida.逆轉(zhuǎn)(P>0.5， 即聯(lián)合用藥的兩實(shí)驗(yàn)組中，EGF的作用與否無差異)．

***表示P<0.01圖2 Chida.逆轉(zhuǎn)EGF誘導(dǎo)的4-OH TAM耐藥Fig.2 Chida. reverses EGF-induced 4-OH TAM resistance

2.3 Chida.對(duì)EGF相關(guān)通路活性的影響

通過檢測(cè)MCF-7中EGF相關(guān)通路蛋白及其磷酸化水平變化，發(fā)現(xiàn)EGF顯著促進(jìn)其下游通路上激酶(MEK1/2、ERK1/2和AKT等)的活化(磷酸化)，而Chida.處理可以明顯降低其活化水平．此外，Chida.處理還降低ER磷酸化，尤其在EGF與Chida.同時(shí)存在時(shí)，ER磷酸化仍被顯著抑制，顯示出Chida.可通過獨(dú)特的ER通路抑制活性，阻斷EGF對(duì)ER活性的維持(圖3)．

圖3 Chida.對(duì)EGF及ER通路相關(guān)激酶活性的影響Fig.3 Inhibition of Chida. on activation of EGF and ER pathway-related kinases

2.4 Chida.聯(lián)合內(nèi)分泌治療的體內(nèi)藥效

在MCF-7原位移植瘤裸鼠模型上給藥4周后，Chida.(20 mg/kg, QD)和內(nèi)分泌治療藥物Ful.(50 mg/kg, QW)2個(gè)單藥組均能顯著抑制移植瘤生長；Chida.+Ful.聯(lián)用時(shí)抑制效果更明顯(P<0.01)， 腫瘤體積保持在給藥前基線水平，幾乎完全抑制了腫瘤生長．同時(shí)各藥物處理組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量無明顯變化，表明兩藥在協(xié)同藥效的同時(shí)無明顯毒性增加(圖4)．

圖4 Ful.和Chida.聯(lián)合用藥的體內(nèi)藥效Fig.4 In vivo anti-tumor effects of Ful.combined with Chida.

Ki-67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，是病理分析中判斷腫瘤細(xì)胞增殖情況的重要指標(biāo)之一，免疫組織化學(xué)染色陽性率越高表示正在增殖的腫瘤細(xì)胞越多[12]．如圖5，通過對(duì)各動(dòng)物模型的腫瘤樣本進(jìn)行Ki-67免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)與溶劑對(duì)照組，Chida.單藥、Ful.單藥及Chida.+Ful.聯(lián)用組中，Ki-67陽性的增殖細(xì)胞均減少，且兩藥聯(lián)用組減少最為明顯，表明Chida.與Ful.對(duì)體內(nèi)ER陽性腫瘤細(xì)胞有顯著的聯(lián)合抑制藥效．

圖5 Ki-67免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(×20)Fig.5 Results of immunohistochemical staining of Ki-67(×20)

3 討 論

HDAC是參與蛋白乙?；揎椀囊粋€(gè)蛋白酶家族，主要針對(duì)染色質(zhì)組蛋白以及其它非組蛋白底物(如p53、Rb和NF-kB、STATs等)的乙?；M(jìn)而影響染色質(zhì)空間構(gòu)象以及轉(zhuǎn)錄因子類底物蛋白的活性，最終改變特定基因群的轉(zhuǎn)錄，屬于重要的表觀遺傳調(diào)控形式[13]．HDAC抑制劑通過誘導(dǎo)抑癌基因和促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄活化，抑制腫瘤細(xì)胞生長．除此以外，HDAC抑制劑還廣泛調(diào)節(jié)多種與腫瘤耐藥或生長依賴性信號(hào)相關(guān)的通路活性，已有研究提示，HDAC抑制劑可以誘導(dǎo)ER陰性乳腺癌細(xì)胞中的ER表達(dá)，從而恢復(fù)對(duì)抗雌激素藥物的敏感性、抑制芳香化酶活性與芳香化酶抑制劑產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，并抑制EGF受體介導(dǎo)的旁路生長信號(hào)通路[14-16]．因此，在乳腺癌治療中，聯(lián)合HDAC抑制劑具有增強(qiáng)傳統(tǒng)抗雌激素治療敏感性和長期療效的應(yīng)用潛力．

本研究首先在ER陽性乳腺癌細(xì)胞模型中評(píng)價(jià)了亞型選擇性HDAC抑制劑Chida.與內(nèi)分泌治療藥物的聯(lián)合藥效，觀察到二者具有一定藥效疊加．在4-OH TAM耐藥模型中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Chida.可顯著逆轉(zhuǎn)EGF所誘導(dǎo)的耐藥．研究初步探討了相關(guān)機(jī)制，結(jié)果表明Chida.能夠顯著抑制EGF通路下游激酶及ER的磷酸化，因此，Chida.可能通過改變生長因子介導(dǎo)的信號(hào)通路活性增強(qiáng)激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療的敏感性．此外，在原位移植瘤動(dòng)物模型體內(nèi)，也證實(shí)了Chida.與內(nèi)分泌治療藥物聯(lián)用時(shí)具有相對(duì)單藥更明顯的腫瘤抑制效果．綜上，Chida.可能在針對(duì)難治/復(fù)發(fā)的ER陽性乳腺癌治療中發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，進(jìn)一步的臨床研究將可能更深入發(fā)掘其聯(lián)合內(nèi)分泌治療的應(yīng)用價(jià)值．